ELISA試驗(yàn)夾心、間接及競爭測定法的操作過程
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種免疫測定方法，通常用于量化樣品中特定目標(biāo)的水平。常規(guī)用于ELISAs的樣本包括血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)通常在96孔微孔板中進(jìn)行，微孔板上涂有對相關(guān)分析物的特異性捕獲抗體。在與實(shí)驗(yàn)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贩趸瘯r，目標(biāo)分析物被該抗體捕獲，一個共軛的檢測抗體與目標(biāo)分析物上的不同表位結(jié)合。隨后加入底物溶液，產(chǎn)生一個與分析物結(jié)合量成比例的信號。ELISA的三個主要方法是夾心法、間接法、和競爭法，每種類型的ELISA都有自己的優(yōu)勢和劣勢。
操作過程如下：
1 、夾心法：
原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進(jìn)行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2、間接法
原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。
間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)。
c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結(jié)。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗體的含量。
3、競爭法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機(jī)制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié)，即所謂競爭法之由來。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當(dāng)需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。
操作過程如下：
1 、夾心法：
原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進(jìn)行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2、間接法
原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。
間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)。
c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結(jié)。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗體的含量。
3、競爭法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機(jī)制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié)，即所謂競爭法之由來。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當(dāng)需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。
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