本文來自于:TSS轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)譜

變構(gòu)代表了蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的基本機(jī)制，能夠從活性位點(diǎn)遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能。傳統(tǒng)上是在小分子背景下進(jìn)行探索，但目前變構(gòu)調(diào)節(jié)作為抗體領(lǐng)域的主要作用模式正在受到關(guān)注，它提供了增強(qiáng)的特異性和降低的毒性。

這篇近期發(fā)表于【Trends in pharmacological sciences】的綜述，詳細(xì)深入闡述了變構(gòu)抗體領(lǐng)域快速的發(fā)展，還探討了這些抗體作為藥物發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新工具的潛力，并討論了利用最先進(jìn)的計(jì)算方法設(shè)計(jì)新型變構(gòu)抗體的當(dāng)前策略。

與變構(gòu)抗體相關(guān)的定義:變構(gòu)現(xiàn)象(Allosterism) 是在小分子世界中開始發(fā)現(xiàn)并發(fā)展的。然而，抗體在結(jié)構(gòu)和機(jī)制上是不同的藥物。因此，需要一個新的詞匯來描述通過與變構(gòu)位點(diǎn)/表位結(jié)合起作用的抗體及其作用。根據(jù)定義，變構(gòu)位點(diǎn)/表位是一種在拓?fù)渖喜煌�于配體結(jié)合區(qū)域的蛋白質(zhì)區(qū)域。值得注意的是，由于抗體是大分子，如果抗體與配體結(jié)合殘基非常接近地結(jié)合并由于其大小而阻礙它們，則出現(xiàn)空間位阻，不會被視為變構(gòu)。此外，抗體與屬于配體結(jié)合位點(diǎn)的殘基的結(jié)合，即使當(dāng)這些殘基處于非活性構(gòu)象時，也不被視為變構(gòu)。此外，變構(gòu)作用是所有蛋白質(zhì)的固有特性，不僅是受體或酶，而且是可以被抗體靶向的蛋白質(zhì)配體。作者提出以下定義：變構(gòu)抗體是一種與靶點(diǎn)/表位結(jié)合的抗體，該位點(diǎn)/表位與配體結(jié)合位點(diǎn)不重疊或空間重疊，隨后對靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)動力學(xué)產(chǎn)生影響，最終調(diào)節(jié)其結(jié)合和/或活性。負(fù)向變構(gòu)抗體調(diào)節(jié)劑（NAAM，negative allosteric antibody modulator ）是一種穩(wěn)定并促進(jìn)不利于配體、受體或共受體結(jié)合和/或活性（信號傳導(dǎo)）的構(gòu)象的抗體。正向變構(gòu)抗體調(diào)節(jié)劑（PAAM，positive allosteric antibody modulator）是一種穩(wěn)定并促進(jìn)有利于配體、受體或共受體結(jié)合和/或活性（信號傳導(dǎo)）的構(gòu)象的抗體�？贵w介導(dǎo)的變構(gòu)效應(yīng)是對靶蛋白的影響，導(dǎo)致抗體與變構(gòu)位點(diǎn)/表位結(jié)合，從而對其功能動力學(xué)產(chǎn)生影響。這些效應(yīng)包括：活性/非活性狀態(tài)下構(gòu)象的調(diào)節(jié)、活性的激活/抑制、與配偶體（配體、受體、共受體）的結(jié)合的增強(qiáng)/抑制，包括二聚化、靶標(biāo)的內(nèi)化，甚至靶標(biāo)的拆卸。

1. 變構(gòu)和抗體
作為一種無所不在的機(jī)制，變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能動態(tài)。靶向變構(gòu)位點(diǎn)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象動力學(xué)的擾動，從而提供了另一種調(diào)節(jié)分子功能的方法。認(rèn)識到需要探索新的范例來克服耐藥性并解決靶標(biāo)空間限制，變構(gòu)調(diào)節(jié)正在作為一種有吸引力的方式。雖然小分子傳統(tǒng)上被報(bào)道為變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，但最近才出現(xiàn)肽，抗體可能具有更明顯的優(yōu)勢�？贵w是對治療產(chǎn)生巨大影響的大分子，其中 達(dá)160+多種抗體已獲得全球衛(wèi)生當(dāng)局批準(zhǔn)用于各個治療領(lǐng)域。與其他藥物相比，抗體由于其較大的結(jié)合位點(diǎn)而呈現(xiàn)出更高的選擇性。它們的溶解度使它們適合靶向膜結(jié)合蛋白和可溶性蛋白。此外，它們的半衰期更長，可以介導(dǎo)靶標(biāo)效應(yīng)器功能。

2. 變構(gòu)抗體：新型成藥途徑對變構(gòu)抗體的探索開辟了藥物發(fā)現(xiàn)和治療開發(fā)的新領(lǐng)域。通過靶向變構(gòu)位點(diǎn)，這些抗體提供了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的創(chuàng)新機(jī)制，推進(jìn)了各種疾病的治療。

2.1 歷史視角
歐洲藥品管理局 (EMA) 和/或 FDA 批準(zhǔn)的治療性抗體開發(fā)的關(guān)鍵里程碑改變了免疫學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域?qū)ψ儤?gòu)機(jī)制的理解（圖 1）。
 

圖 1.變構(gòu)抗體開發(fā)的關(guān)鍵里程碑。

第一個批準(zhǔn)的抗體，muromonab-CD3 (OKT3)，于 1986 年推出。它針對 CD3 的 epsilon 結(jié)構(gòu)，CD3 是 T 細(xì)胞表面 T 細(xì)胞受體 (TCR) 的一部分。CD3 并不參與 TCR 介導(dǎo)的抗原識別，而是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，最近的生化研究表明，muromonab-CD3不會與 CD3 抑制性配體競爭。相反，晶體研究揭示了 muromonab-CD3 與 CD3 構(gòu)象表位的結(jié)合。它通過抗體-受體復(fù)合物的結(jié)合和隨后的內(nèi)化來防止以變構(gòu)方式識別抗原（圖1）。通過內(nèi)化選擇性去除 TCR 會抑制 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒功能并促進(jìn)非免疫功能的 T 細(xì)胞狀態(tài)。muromonab-CD3 被批準(zhǔn)用于預(yù)防器官排斥十年后，抗體開始被批準(zhǔn)用于腫瘤學(xué)應(yīng)用。HER2 是一種跨膜受體酪氨酸激酶 (RTK)，通常在癌細(xì)胞中過度表達(dá)，有助于生長和增殖。盡管尚未鑒定出 HER2 的配體，但基于其與同一家族其他受體的相似性，通常推斷其胞外結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域 I 和 III 之間的裂口。已經(jīng)開發(fā)出針對 HER2 的抗體，包括曲妥珠單抗 (Herceptin) 和帕妥珠單抗 (Perjeta)。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)揭示了曲妥珠單抗與結(jié)構(gòu)域 IV 的結(jié)合，而帕妥珠單抗則靶向二聚化界面（結(jié)構(gòu)域 II）�；�于細(xì)胞的檢測強(qiáng)調(diào)，HER2 靶向抗體會對 HER2 二聚化和隨后的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)面影響，并促進(jìn)抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化（圖 1 ）。這些抑制性抗體可被稱為變構(gòu)抗體，因?yàn)樗鼈儗?HER2 具有非配體競爭性抑制作用。 2010 年代標(biāo)志著一種稱為雙特異性的新型抗體形式的首次亮相，因?yàn)樗鼈兛梢越Y(jié)合兩個不同的靶標(biāo)。 大多數(shù)雙特異性抗體被歸類為T 細(xì)胞接合劑。它們可以同時結(jié)合 T 細(xì)胞上 TCR 的 CD3 部分和癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原 (TAA)。雙特異性抗體將 T 細(xì)胞導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞。臨床前模型表明，這些雙特異性抗體起到條件激動劑的作用，T 細(xì)胞激活依賴于同時結(jié)合 CD3 和 TAA。T 細(xì)胞通過獨(dú)立于 TCR 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的機(jī)制被激活，依賴于與 TCR 變構(gòu)位點(diǎn) CD3 的結(jié)合（圖 1）。這種雙特異性形式不會導(dǎo)致受體內(nèi)化，但可以介導(dǎo)激活信號傳導(dǎo)。一個突出的例子是重磅炸彈 epcoritamab (Epkinly)，它靶向 T 細(xì)胞上的 CD3 和 B 細(xì)胞上的 CD20，并被批準(zhǔn)用于治療 B 細(xì)胞惡性腫瘤。在2020年前些時候，抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）形式的新時代出現(xiàn)了。ADC 是一類新型抗體療法，帶有細(xì)胞毒性有效負(fù)載。 它們以快速內(nèi)化的膜結(jié)合蛋白為目標(biāo)，允許有毒有效負(fù)載在細(xì)胞內(nèi)釋放，最終導(dǎo)致表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞被消除。HER2 靶向 ADC 基于曲妥珠單抗，通過變構(gòu)作用機(jī)制發(fā)揮作用。如前所述，曲妥珠單抗與 HER2 的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化（圖 1）。因此，基于曲妥珠單抗的 ADC 已被開發(fā)并獲得批準(zhǔn)，例如曲妥珠單抗 deruxtecan (Enhertu)，用于治療表達(dá) HER2 的某些類型的腫瘤。 基于駱駝抗體的小型可變結(jié)構(gòu)域，稱為 VHH（重鏈可變重結(jié)構(gòu)域）的新模式已得到進(jìn)一步批準(zhǔn)。第一種基于 VHH 的治療劑caplacizumab (Cablivi)可結(jié)合 vWF 因子，這是一種促進(jìn)血小板粘附的血液糖蛋白。 與 vWF 相關(guān)的自身免疫性血液疾病會導(dǎo)致血栓形成。結(jié)構(gòu)研究表明，caplacizumab 通過與不同于血小板受體糖蛋白 Ib 的位點(diǎn)結(jié)合，穩(wěn)定了 vWF 對血小板粘附的非活性構(gòu)象，從而防止了危及生命的血栓形成（圖 1）。 值得注意的是，sotrovimab (Xevudy) 靶向受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且不與受體 (ACE2) 結(jié)合位點(diǎn)重疊（圖 1）。這種近距離破壞了附著后的構(gòu)象變化，從而中和了COVID-19感染。大量的計(jì)算工作，特別是分子動力學(xué) (MD)研究表明，strovimab 通過與已知的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，在刺突蛋白內(nèi)誘導(dǎo)變構(gòu)擾動。此外，sotrovimab 與對突變不太敏感的表位結(jié)合，有助于中和其他 SARS-CoV-2 刺突突變蛋白。這些研究代表了全球首次將計(jì)算和實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合起來，以快速發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和表征中和變構(gòu)抗體。最近的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法闡明了探索性靶點(diǎn)的變構(gòu)作用機(jī)制，這些靶點(diǎn)被認(rèn)為是抗體不可成藥的，從而揭示了新的成藥途徑。

2.2. GPCR 和配體門控離子通道 (LGIC)：靶向跨膜受體的新進(jìn)展
GPCR和 LGIC 是兩個最常見的藥物靶點(diǎn)。然而，盡管付出了巨大的努力，但很少有抗體能夠靶向這些膜嵌入的蛋白質(zhì)類別。GPCR 構(gòu)成了藥物治療的主要靶點(diǎn)，大約三分之一的批準(zhǔn)藥物以它們?yōu)榘袠?biāo)。然而，這些藥物中只有三種是抗體。這種未滿足的缺口是由 GPCR 的小且可接近的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域引起的，GPCR 也是一種特別難以表達(dá)的蛋白質(zhì)類別。Scholler 等報(bào)告了一種基于 VHH 的 GPCR 正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑：mGlu2 的發(fā)現(xiàn)。mGlu 受體家族是一種C 類 GPCR，由一種稱為代謝型谷氨酸的神經(jīng)遞質(zhì)激活。這些受體是治療腦相關(guān)疾病的有希望的靶標(biāo)，VHH 可能是治療這些疾病的替代藥物。結(jié)構(gòu)研究揭示了 mGlu2 靶向 VHH 與 Venus Flytrap (VFT) 葉的結(jié)合以及受體活性形式的整體穩(wěn)定（圖 2），從而在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出激動活性。這種結(jié)構(gòu)不同于 mGlu 的非活性形式（圖 2）。此外，VFT 結(jié)構(gòu)域還擁有一個重要的 mGlu 受體變構(gòu)位點(diǎn)。還報(bào)道了針對 mGlu4 的其他變構(gòu)抗體，mGlu5 和 mGlu7。有趣的是，靶向 mGlu7 的抗體通過促進(jìn)活性受體復(fù)合物的內(nèi)化，與正構(gòu)和變構(gòu)激動劑表現(xiàn)出負(fù)協(xié)同作用。
 

圖 2.抗體與靶蛋白變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合引起的構(gòu)象變化。

此外，最近的一份報(bào)告描述了一種抑制鈣敏感受體（CaSR）的變構(gòu)抗體。CaSR 是另一種C 類 GPCR，可感應(yīng)體內(nèi)鈣濃度。該受體的激活突變會導(dǎo)致低鈣血癥。有趣的是，冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 證明與也位于受體 VFT 結(jié)構(gòu)域上的表位結(jié)合。VHH 結(jié)合并穩(wěn)定 CaSR 的非活性狀態(tài)，從而抑制其信號傳導(dǎo)。此外，Cui 等證明了這種VHH 增強(qiáng)了其他 CaSR 拮抗劑的抑制作用，特別是包括小分子負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。LGIC 是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子通量的跨膜蛋白。它們構(gòu)成了第二大治療靶標(biāo)類別。乙酰膽堿受體（AChR）是變構(gòu)背景下最廣泛表征的受體之一，盡管事實(shí)上僅報(bào)道了小分子變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。最近，Corringer 的研究組發(fā)現(xiàn)了一種 VHH，它可以作為 α7-nAChR 的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑[]。他們的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)揭示了這種 VHH 穩(wěn)定了激動劑結(jié)合構(gòu)象并增強(qiáng)了乙酰膽堿引發(fā)的電流 [10.1038/s41467-023-41734-4 ]。這些研究為利用 VHH 靶向 LGIC 的新方法提供了希望。LGIC 變構(gòu)調(diào)節(jié)的另一個引人注目的例子是針對N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDA)的抗體：GluN2B。該抗體專門穩(wěn)定并鎖定 GluN1-GluN2B 復(fù)合體的非活性構(gòu)象，從而消除其功能。通過 MD 模擬，Tajima 和同事強(qiáng)調(diào)了抗體結(jié)合時的長程變構(gòu)通訊，將受體的數(shù)量轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚詷?gòu)象狀態(tài)[ 10.1038/s41467-022-28559-3]。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了使用計(jì)算方法驗(yàn)證變構(gòu)通信的重要性，以全面了解抗體如何變構(gòu)發(fā)揮作用�？傊�，由于變構(gòu)擾動，GPCR 和 LGIC 在活性和非活性狀態(tài)之間經(jīng)歷了重大構(gòu)象變化。這種動態(tài)性質(zhì)使它們特別適合表現(xiàn)出變構(gòu)作用模式的抗體的靶標(biāo)。

2.3. 新藥理學(xué): LRRK2、ENPP1、IL-18Rβ
作用于變構(gòu)位點(diǎn)的抗體可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的信號傳導(dǎo)，該信號傳導(dǎo)可能在多種疾病中失調(diào)。治療退行性疾病、癌癥和自身免疫性疾病的突破性發(fā)現(xiàn)已經(jīng)出現(xiàn)，凸顯了調(diào)節(jié)這些靶蛋白的新藥理學(xué)。富含亮氨酸重復(fù)激酶 2 (LRRK2) 是一種大型多結(jié)構(gòu)域蛋白激酶，在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；這種蛋白質(zhì)的突變是遺傳性帕金森病的主要原因。LRRK2 治療的主要重點(diǎn)是競爭性抑制劑，該抑制劑對 LRKK2 的特異性較差。Singh 及其同事旨在發(fā)現(xiàn)針對 LRRK2 各個部分的 VHH。他們將免疫和篩選結(jié)合起來，使抗體發(fā)現(xiàn)過程偏向表現(xiàn)出變構(gòu)作用模式的抗體。有趣的是，一組變構(gòu) VHH 被鑒定出來。通過蛋白質(zhì)交聯(lián)，這些結(jié)合殘基被映射到活性位點(diǎn)之外，證明 VHH 穩(wěn)定了 LRRK2 的非活性構(gòu)象。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了利用變構(gòu)位點(diǎn)開發(fā)新的 LRRK2 靶向藥物來調(diào)節(jié)其活性的潛力[10.1073/pnas.2112712119]。最近，一項(xiàng)綜合研究詳細(xì)介紹了首次鑒定出靶向并抑制胞外域磷酸酶/磷酸二酯酶-1 (ENPP1) 的 VHH，ENPP1 是一種在癌癥中過度表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)。Solomon 及其同事獲得了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，以確認(rèn)抗體與位于水解酶活性位點(diǎn)附近的神秘變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合。除了誘變研究之外，他們還確定了調(diào)節(jié) ENPP1 底物特異性抑制的關(guān)鍵獨(dú)特結(jié)合殘基。該 VHH 是第一個報(bào)道的 ENPP1生物抑制劑，揭示了變構(gòu)抑制的新機(jī)制。這一突破性發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了各種抗體形式的設(shè)計(jì)和探索，包括針對另一個免疫檢查點(diǎn) PD-L1 的雙特異性抗體。這種形式表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞活性，與小分子相比表現(xiàn)出更大的特異性。 白細(xì)胞介素受體 (IL-R) 在細(xì)胞通訊中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其失調(diào)與炎癥性疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。因此，阻斷白細(xì)胞介素信號傳導(dǎo)可能會帶來顯著的治療益處。Liu 及其同事報(bào)道了一種針對IL-18Rβ的合成抗體的開發(fā)。作者獲得了該復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了該抗體與 IL-18Rβ 的一個位點(diǎn)結(jié)合，該位點(diǎn)與 IL-18 結(jié)合位點(diǎn)不同�？贵w結(jié)合引起IL-18Rβ的顯著構(gòu)象變化，從而修飾了IL-18和IL-18Rα的結(jié)合位點(diǎn)（圖2），從而阻礙了三元復(fù)合物IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ的形成以及隨后的形成。信令[10.1016/j.jmb.2020.01.012]。

2.4. 變構(gòu)作用阻止感染
傳染病是由病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲引起的。靶向病毒或細(xì)菌蛋白的變構(gòu)位點(diǎn)具有顯著的優(yōu)勢，因?yàn)檫@些位點(diǎn)往往對突變不太敏感。例如，諾如病毒是全球胃腸炎流行的主要原因。這些病毒可以在其衣殼蛋白中積累大量突變，盡管付出了巨大的努力，但尚未批準(zhǔn)基于抗體的治療方法。有趣的是，中和表位已在附著位點(diǎn)之外被識別，并且一組 VHH 已被表征。Salmen 及其同事獲得了 VHH 的晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可識別大多數(shù)衣殼蛋白變體，揭示了與遠(yuǎn)離配體結(jié)合位點(diǎn)的表位的結(jié)合（圖 2 ）。生物物理測定和冷凍電鏡表明，VHH 結(jié)合改變了衣殼的結(jié)構(gòu)動力學(xué)，最終導(dǎo)致分解[10.1038/s41467-023-42146-0 ]。這些發(fā)現(xiàn)為靶向病毒的變構(gòu)活性區(qū)域提供了獨(dú)特的機(jī)會，可能阻止感染并促進(jìn)病毒顆粒的破壞。金黃色葡萄球菌等細(xì)菌也可能引起感染，這種細(xì)菌會釋放強(qiáng)力毒素葡萄球菌腸毒素 B (SEB)。Fan 和同事最近從患者身上鑒定出一種抗體，該抗體針對 SEB 上的線性保守表位。它們的晶體結(jié)構(gòu)揭示了遠(yuǎn)離 SEB 受體（MHC-II 和 TCR）的結(jié)合位點(diǎn)。生化和基于細(xì)胞的測定表明，該抗體會對 MHC-II 和 TCR 與 SEB 的結(jié)合產(chǎn)生負(fù)面影響，干擾三元復(fù)合物的形成，表明變構(gòu)抑制[10.1080/21645515.2024.2360338]。該抗體在體外和體內(nèi)中和了 SEB 誘導(dǎo)的毒性和細(xì)菌感染，開辟了一種對抗細(xì)菌感染的新策略。

2.5. 靶向 TNF 受體超家族 (TNFRSF) 的變構(gòu)激動劑抗體
激活信號傳導(dǎo)的激動劑抗體已成為恢復(fù)或增強(qiáng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的有前景的生物制劑。許多激動劑抗體靶向 TNFRSF 中的共刺激受體，TNFRSF 是細(xì)胞因子受體的超家族。有趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作用于這些受體變構(gòu)位點(diǎn)的激動劑抗體。在這些受體中，4-1BB，也稱為CD137，是用于癌癥免疫治療的 T 細(xì)胞的一個有前景的靶標(biāo)。Urelumab是一種靶向 4-1BB 的激動劑抗體，與 4-1BB 配體 (4-1BBL) 位點(diǎn)遠(yuǎn)端的位點(diǎn)結(jié)合。它會引起 4-1BB 內(nèi)的構(gòu)象變化，從而改變其空間方向，從而導(dǎo)致外觀更加彎曲（圖 2 ）。此外，如共焦成像所示，該抗體可促進(jìn)受體聚集。與與 4-1BBL 競爭的其他第一代抗 4-1BB 抗體相比，Urelumab 可誘導(dǎo)更強(qiáng)的 4-1BB 激活 [10.1038/s41467-018-07136-7 ]。除了激動劑作用外，變構(gòu)抗體還可以自然識別配體，從而提供增強(qiáng)靶向方法的可能性。OX40 是 TNFRSF 的另一個成員，據(jù)報(bào)道也受到抗體的變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)抗 OX40 抗體的基本原理是增加與 OX40 激活相關(guān)的功效，而不損害其天然配體 OX40L 的識別。共晶結(jié)構(gòu)表明，該抗體與 OX40 的另一面（如 OX40L）結(jié)合在近端表位上[10.1007/s11684-023-0996-8]。在臨床前模型中，據(jù)報(bào)道該抗體可促進(jìn) IL-2 分泌，從而增加 T 細(xì)胞增殖。作用于變構(gòu)位點(diǎn)的抗體可以充當(dāng)激動劑抗體，激活 TNFRSF 中共受體的信號傳導(dǎo)。這種激活不僅由靶標(biāo)表位決定，而且還可以通過同種型選擇來增強(qiáng)。值得注意的是，IgG2 形式的靈活性不如其他 IgG，這表明抗體與其同源靶蛋白之間存在額外的通信。2.6 抗體鉸鏈區(qū)對激動性的重要性

Yang 及其同事討論了不同的 IgG 亞類盡管具有相同的可變區(qū)，但由于其恒定區(qū)的變化而表現(xiàn)出不同的功能特性。這些差異會影響抗原結(jié)合親和力、特異性和效應(yīng)器功能。鉸鏈?zhǔn)强贵w的核心部分，提供靈活性并促進(jìn)抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)的通訊。與 IgG1 形式相比，IgG2 形式在其鉸鏈區(qū)具有額外的二硫鍵，這增加了其剛性。IgG2 賦予 TNFRSF 中多個靶標(biāo)的激動特性。當(dāng)修改針對TNFRSF的另一個成員CD40的抗體同種型時，可以觀察到功能的轉(zhuǎn)換，特別是激動劑和拮抗劑活性之間的翻轉(zhuǎn)。拮抗性抗CD40抗體可以通過采用IgG2形式修飾為超級激動劑，在體外研究中其效力超過其他激動劑抗體。因此，鉸鏈靈活性和激動性之間的反比關(guān)系正在出現(xiàn)（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了范式轉(zhuǎn)變，其中靶向表位和抗體形式對于活性發(fā)揮著同等的作用。這使得理解抗體的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系變得極其困難，并凸顯了設(shè)計(jì)完整抗體結(jié)構(gòu)的挑戰(zhàn)性。

圖3. 鉸鏈靈活性和對抗特性之間的反比關(guān)系。

2.7. 變構(gòu)抗體的新興形式
通過變構(gòu)機(jī)制成功調(diào)節(jié)靶蛋白正在為下一代抗體形式的工程化鋪平道路。除了 T 細(xì)胞結(jié)合劑之外，雙特異性抗體還可以充當(dāng)自然殺傷 (NK) 細(xì)胞結(jié)合劑。這些分子靶向 NK 細(xì)胞上的受體和癌細(xì)胞上的 TAA。如針對 NKp30 和 EGFR（另一種與 HER2 結(jié)構(gòu)相似的 RTK）變構(gòu)位點(diǎn)的功能性雙特異性抗體形式，證明了 NK 細(xì)胞的參與并增強(qiáng)了腫瘤活性。與 T 細(xì)胞類似，NK 細(xì)胞可以獨(dú)立于配體結(jié)合而被重定向和激活。一種新形式的條件激活性抗體，其活性受環(huán)境調(diào)節(jié)以發(fā)揮其潛力，可以增強(qiáng)抗體的特異性。如由基于鈣調(diào)蛋白接頭的可切換抗體片段組成。鈣調(diào)蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)換促使抗體片段內(nèi)的構(gòu)象變化影響抗原結(jié)合，使這種形式成為可以進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)的超組裝復(fù)合體。

3. 變構(gòu)工具抗體：超越治療應(yīng)用對變構(gòu)抗體的探索為未來的治療發(fā)展帶來了巨大的希望，有可能帶來更有效、更有針對性的治療。這種變構(gòu)抗體是藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的突破性進(jìn)展，提供了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的獨(dú)特機(jī)制。雖然它們的治療應(yīng)用有據(jù)可查，但這些抗體也可以在更廣泛的藥物發(fā)現(xiàn)背景下作為寶貴的工具。

3.1 支持高通量篩選
蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定是藥物化學(xué)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，對通過高通量篩選（HTS）發(fā)現(xiàn)小分子做出了重大貢獻(xiàn)。最近，基因泰克的研究人員報(bào)告發(fā)現(xiàn)了能夠結(jié)合并穩(wěn)定 KRAS 特殊構(gòu)象的抗體，類似于已批準(zhǔn)的抗 KRAS 小分子誘導(dǎo)的構(gòu)象。70]。KRAS 是一種在癌癥中失調(diào)的細(xì)胞內(nèi)蛋白。雖然傳統(tǒng)上治療抗體無法接近，但它仍然是小分子的主要目標(biāo)。長期以來，KRAS 被認(rèn)為是不可成藥的，直到構(gòu)象口袋的識別和利用。通過捕獲這種獨(dú)特的構(gòu)象，這些抗體可促進(jìn) HTS 并提高新型治療化合物的發(fā)現(xiàn)率。同樣，ConfoTherapeutics 開發(fā)了其專有的 高通量篩選 ConfoBodies 平臺，該平臺利用構(gòu)象穩(wěn)定的 VHH 來支持靶向 GPCR 的小分子的 HTS。這些 ConfoBodies 選擇性地穩(wěn)定 GPCR 的活性或非活性構(gòu)象異構(gòu)體。

3.2 結(jié)構(gòu)研究的伴侶
構(gòu)象變化使研究人員能夠表征各種靶蛋白的無序區(qū)域。歷史上，蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定是通過與片段抗原結(jié)合 (Fab) 共結(jié)晶來實(shí)現(xiàn)的。如今，VHH 等較小的抗體片段在 GPCR 等復(fù)雜蛋白質(zhì)的研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 并且對于獲得高分辨率結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，特別是對于捕獲獨(dú)特的構(gòu)象。此外，還報(bào)道了一種針對 TNF 的抗體，該抗體與 TNF 的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，有助于闡明 TNF-TNFR1 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而深入了解其動態(tài)�？傊�，變構(gòu)抗體不僅是有價值的治療化合物，而且是藥物發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)大工具。它們穩(wěn)定特定蛋白質(zhì)構(gòu)象的能力增強(qiáng)了 HTS 并促進(jìn)結(jié)構(gòu)研究。它們在推進(jìn)藥物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的作用將擴(kuò)大到更好地理解化合物的作用機(jī)制。

4. 設(shè)計(jì)變構(gòu)抗體的未來方向
發(fā)現(xiàn)變構(gòu)抗體的主要挑戰(zhàn)之一是它們的鑒定，這主要是由于偶然性，盡管一些團(tuán)體提出了有利于變構(gòu)抗體的有偏倚的實(shí)驗(yàn)方法。然而，計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新進(jìn)展顯著增強(qiáng)了我們識別相關(guān)變構(gòu)位點(diǎn)的能力。這些計(jì)算方法可以與從頭抗體設(shè)計(jì)的初始步驟相結(jié)合，為開發(fā)變構(gòu)抗體提供更系統(tǒng)的方法。

4.1 變構(gòu)位點(diǎn)鑒定
有多種計(jì)算方法可用于識別變構(gòu)位點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)方法主要側(cè)重于識別小分子可以結(jié)合的口袋。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，例如抗體-抗原界面，由于其動態(tài)性質(zhì)和大尺寸，需要更通用的方法。除了尋找口袋之外，更通用的方法是識別靶標(biāo)蛋白中的變構(gòu)網(wǎng)絡(luò)以及關(guān)鍵區(qū)域之間的相應(yīng)通信。這種理論理解源于蛋白質(zhì)變構(gòu)通訊的進(jìn)化保守性，盡管它們的結(jié)構(gòu)和序列存在可變性。例如，通過評估靶標(biāo)蛋白不同區(qū)域之間響應(yīng)結(jié)合事件和突變的能量學(xué)和因果關(guān)系，基于結(jié)構(gòu)的變構(gòu)統(tǒng)計(jì)模型（SBSMMA），提供了變構(gòu)表位鑒定的框架。納入AlloSigMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，SBSMMA 允許通過靶蛋白正位點(diǎn)的擾動（即反向擾動方法）來檢測變構(gòu)活性區(qū)域，與機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）方法相結(jié)合，有可能實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的預(yù)測能力。

4.2 邁向從頭設(shè)計(jì)變構(gòu)抗體
對蛋白質(zhì)調(diào)控的理解與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的最新突破相結(jié)合，為設(shè)計(jì)針對給定變構(gòu)位點(diǎn)的抗體提供了絕佳的機(jī)會。人工智能 (AI)和計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新進(jìn)展表明，可以利用 ML 算法從頭生成針對結(jié)合親和力和特異性進(jìn)行優(yōu)化的抗體序列。更好地理解蛋白質(zhì)的變構(gòu)通訊也將有利于抗體的設(shè)計(jì)，因?yàn)榭贵w本身是高度動態(tài)的。抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)的這些通信提供了對抗體功能的新理解，應(yīng)全面考慮抗體功能，而不僅僅是關(guān)注其互補(bǔ)表位�？偠�言之，這些先進(jìn)的計(jì)算方法預(yù)計(jì)將使研究人員能夠有效地定制針對特定變構(gòu)位點(diǎn)的抗體，從而有可能改善治療結(jié)果并減少脫靶效應(yīng)。