外泌體是細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，它們?cè)诩?xì)胞間通訊中扮演著關(guān)鍵角色，并參與多種生理和病理過程。外泌體不僅攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等生物分子，還具有穿越多種生物屏障等能力，為靶向藥物遞送和基因治療提供了一個(gè)全新的平臺(tái)。外泌體工程化技術(shù)經(jīng)由基因改造或化學(xué)修飾等手段提高外泌體的生物活性、穩(wěn)定性以及靶向性，在外泌體藥物遞送及治療應(yīng)用中具有重要應(yīng)用前景。其中通過基因工程方式作為內(nèi)源性工程化外泌體改造的重要方式，在工程化外泌體的開發(fā)中備受關(guān)注。

近日，北京恩澤康泰生物科技有限公司在外泌體工程化改造領(lǐng)域取得重大進(jìn)展，其研究成果發(fā)表于Journal of Extracellular Vesicles。這一發(fā)現(xiàn)拓寬了外泌體支架蛋白的選擇范圍，為外泌體在藥物遞送和基因治療中的應(yīng)用提供了新的可能性。
 

研究背景
由于外泌體能夠調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物表型，大家越來越關(guān)注其作為新型治療載體的潛力。外泌體具備免疫原性有限、毒性低和跨越血腦屏障能力等優(yōu)勢，可保護(hù)封裝的貨物分子以及體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，克服了合成藥物遞送系統(tǒng)的局限性。但外泌體的臨床應(yīng)用也面臨諸多挑戰(zhàn)，如給定生物分子含量低、循環(huán)時(shí)間短、肝臟主導(dǎo)的生物分布等。此外，量產(chǎn)工藝不成熟和缺乏完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也限制了其發(fā)展。為了克服上述的問題，科研人員通過基因工程或化學(xué)修飾對(duì)外泌體進(jìn)行工程化改造，以改善其生物活性、載藥能力和靶向性等。改造方法之一是將目標(biāo)蛋白(protein of interest，POI)通過與支架蛋白融合的方式導(dǎo)入外泌體，實(shí)現(xiàn)生成前的蛋白質(zhì)改造或內(nèi)源蛋白質(zhì)改造。這種方法可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定大批量制備，并根據(jù)需要將POI展示在外泌體的表面或內(nèi)部。目前，常見的外泌體支架蛋白分為三類，分別是四跨膜蛋白(CD63，CD9，CD81等)、膜周蛋白(MFGE8)，以及I型跨膜蛋白(Lamp2b，PTGFRN等)三類。但這些支架蛋白仍存在不足，如四跨膜蛋白的N端和C端均位于膜內(nèi)，當(dāng)需要在外泌體的表面展示POI時(shí)，只能對(duì)外表面的loop結(jié)構(gòu)進(jìn)行融合改造，加大了分子設(shè)計(jì)和驗(yàn)證的難度；膜周蛋白MFGE8與膜表面蛋白的結(jié)合力弱，一旦融合分子量較大的POI后，在外泌體上的含量就會(huì)迅速降低；Lamp2b適合N端融合，C端融合則會(huì)影響其分揀能力。為了讓外泌體工程化改造技術(shù)能夠更好地服務(wù)于外泌體創(chuàng)新療法的開發(fā)，篩選新型支架蛋白的努力從未停止。而此前篩選外泌體支架蛋白的標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下四點(diǎn)：

1. 在外泌體上的高水平表達(dá)；
2. 較小的分子量；
3. 具有適合的改造位點(diǎn)；
4. 本身不應(yīng)具有明顯的生物學(xué)功能。

然而，能夠同時(shí)滿足上述四個(gè)條件的候選蛋白數(shù)量有限。因此，本文的研究者在此研究策略之上，將支架蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了大幅度的精簡，從之前的四個(gè)減少到以下兩個(gè)：

1. 必須是具有外泌體主動(dòng)分揀能力的I型跨膜蛋白；
2. 在該蛋白的N端以及C端進(jìn)行截短或融合等改造不會(huì)顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。

一、PLXNA1的篩選與鑒定
研究者首先通過高分辨蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)EV中不同蛋白質(zhì)的分揀能力進(jìn)行了初步評(píng)估。結(jié)果顯示，叢蛋白A1(PLXNA1)與經(jīng)典的外泌體富集蛋白(MFGE8、CD81、PTGFRN以及SDCBP等)類似，其相對(duì)豐度在細(xì)胞裂解液(CL)、初純外泌體(UC)和高純外泌體(DGC)之中依次呈現(xiàn)出由低到高的趨勢，而與外泌體樣本中常見的污染蛋白(CANX)呈現(xiàn)出相反的趨勢(圖1c)。并且其在外泌體中的富集程度相較于細(xì)胞裂解液有了顯著提升，其增加的倍數(shù)在所有比較的外泌體富集蛋白中排名第二，僅次于MFGE8(圖1d)。且該結(jié)果得到Western Blot(WB)驗(yàn)證(圖1e)。這些結(jié)果表明PLXNA1滿足了研究者設(shè)定的第一個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)，即具有外泌體主動(dòng)分揀能力的I型跨膜蛋白。
 

圖1. PLXNA1的篩選與鑒定

二、NanoFCM和WB作為評(píng)估支架蛋白EV分揀能力的有效方法
為了評(píng)估PLXNA1是否滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的第二個(gè)要求，研究者開發(fā)了一種基于WB和納米流式的方法來評(píng)估候選支架蛋白的EV分揀能力。WB是從整體水平上對(duì)樣本蛋白進(jìn)行檢測，而NanoFCM則是在單顆粒水平上檢測蛋白陽性率以及平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這兩種方法的結(jié)合有助于全面評(píng)估PLXNA1的EV分揀能力。作者將GFP與支架蛋白CD63和MFGE8分別融合表達(dá)，通過ELISA和WB評(píng)估GFP蛋白分別在EV和CL中的含量以及比值。結(jié)果顯示兩種方法的結(jié)果是一致的，且GFP-CD63的富集程度略高于GFP-MFGE8(圖2b,c,d)。而與之不同的是，NanoFCM的MFI結(jié)果表明，GFP-MFGE8優(yōu)于GFP-CD63(圖2e,f)，這是因?yàn)镚FP MFI反映了融合蛋白的EVs中的表達(dá)，而與細(xì)胞中可能殘留的融合蛋白的數(shù)量無關(guān)。
 

圖2. PLXNA1的EV分揀能力評(píng)估

三、PLXNA1截短和融合不影響外泌體的分揀能力
按照前述的篩選標(biāo)準(zhǔn)，PLXNA1作為外泌體支架蛋白仍存在天然劣勢。首先，其N端和C端各有一個(gè)具有生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域；其次，該蛋白的分子量較大，約為211kDa。所以全長的PLXNA1并不適合作為外泌體支架蛋白。于是研究者對(duì)PLXNA1進(jìn)行了五種不同形式的截短，并且在N端和C端與不同的貨物分子(即IL 12和GFP)進(jìn)行融合改造，結(jié)果顯示該蛋白的多個(gè)截短體均保持了較高的外泌體分揀能力(圖3a,b,c)。這說明PLXNA1也同樣滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的第二條要求，即支架蛋白的N端以及C端進(jìn)行截短或融合等改造不會(huì)顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。
 

圖3. 截短的PLXNA1保持了較高的EV分揀能力

四、PLXNA1截短體作為外泌體支架蛋白的優(yōu)勢
為進(jìn)一步闡明PLXNA1截短體在EV分揀中的優(yōu)勢，研究者將PLXNA1截短體與另外兩種廣泛認(rèn)可的I型跨膜支架蛋白(Lamp2b和PTGFRN)進(jìn)行了頭對(duì)頭的比較，在HEK293和MCF-7細(xì)胞系中PLXNA1截短體均展現(xiàn)出了明顯的載量優(yōu)勢(圖4)。
 

圖4. PLXNA1截短體相較于已知支架具有優(yōu)勢

研究者進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證POI在EV表面和腔內(nèi)的活性。研究者首先將PLXNA1(863-1316)和核糖體蛋白L7AE進(jìn)行融合，并與目標(biāo)mRNA(帶有C/D盒序列的NanoLuc mRNA)共轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中，然后將產(chǎn)生的EV與HepG2細(xì)胞共孵育，以測試融合表達(dá)是否會(huì)影響L7AE的RNA結(jié)合能力。孵育實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NanoLuc-L7AE-EV處理的細(xì)胞中，NanoLuc mRNA水平顯著上調(diào)，且NanoLuc催化活性比用NanoLuc-EV處理的細(xì)胞高出四倍，表明L7AE工程化EVs在遞送目標(biāo)mRNA方面具有優(yōu)勢(圖5b)。此外，若siRNA技術(shù)干擾表達(dá)下，NanoLuc-L7AE-EV處理的細(xì)胞活性降低了30%，進(jìn)一步證實(shí)了受體細(xì)胞中的NanoLuc催化活性來源于mRNA的成功遞送(圖5c)。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，研究者將NanoLuc蛋白直接融合并表達(dá)在PLXNA1(863-1316)的C端，體外實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出劑量依賴性的底物催化活性(圖5d)。同時(shí)，將小鼠IL12(mIL12)與PLXNA1的N端融合，發(fā)現(xiàn)重組mIL12(rmIL12)和mIL12修飾的EVs(EVmIL12)體外實(shí)驗(yàn)中引發(fā)的IFN-γ激活水平相同(圖5e)。這些結(jié)果表明，無論是與支架蛋白的C端還是N端融合，對(duì)蛋白質(zhì)貨物的功能影響有限。

最后，在攜帶MC38腫瘤的小鼠模型中，比較了rmIL12和EVmIL12對(duì)腫瘤生長抑制活性的影響。結(jié)果顯示，EVmIL12在相同劑量下比rmIL12表現(xiàn)出更有效的腫瘤生長抑制活性，并且治療效果呈劑量依賴性(圖5f,g)。這些數(shù)據(jù)綜合表明，融合到外泌體中的PLXNA1截短片段的POIs保持了甚至比重組POIs更強(qiáng)的活性。
 

圖5. 融合PLXNA1截短體的POIs活性評(píng)估

五、基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌體平臺(tái)
研究者構(gòu)建了一個(gè)基于ALFAtag/NbALFA系統(tǒng)的通用外泌體平臺(tái)(圖6a)。通過將NbALFA納米抗體融合表達(dá)在PLXNA1的N端，實(shí)現(xiàn)了帶有ALFAtag標(biāo)簽的重組蛋白與外泌體的高效結(jié)合。這種標(biāo)記方法不僅效率高(圖6b,c)，也不影響POIs的活性(圖6d)。此外，研究者還評(píng)估外泌體的保存過程中的穩(wěn)定，結(jié)果表明基于NbALFA/ALFA系統(tǒng)的工程外泌體可以抵抗至少三次凍融，且能夠在多個(gè)條件下長時(shí)間穩(wěn)定保存(圖6e,f)。由此說明，這種NbALFA/ALFA系統(tǒng)是一種高度通用和穩(wěn)定的外泌體工程技術(shù)。
 

圖6. 基于ALFAtag/NbALFA系統(tǒng)的通用外泌體平臺(tái)的評(píng)估

研究意義
該項(xiàng)研究對(duì)外泌體支架蛋白的篩選條件進(jìn)行了修訂和拓展，為外泌體遞送系統(tǒng)的開發(fā)帶來了更多的可能性，且篩選得到的支架蛋白PLXNA1并在對(duì)其進(jìn)行截?cái)喔脑斓幕�礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)、高活性、高遞送能力和高穩(wěn)定性的工程化外泌體。此外，恩澤康泰構(gòu)建的通用型外泌體開發(fā)平臺(tái)ALFAtag/NbALFA，為工程化外泌體后續(xù)作為藥物載體的應(yīng)用潛力提供了有力證明。該研究成果標(biāo)志著外泌體技術(shù)在藥物遞送和基因治療領(lǐng)域邁出了重要的一步，推動(dòng)了工程化外泌體未來的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。

展望
NanoFCM不僅可對(duì)EVs的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質(zhì)進(jìn)行分析，還對(duì)EVs的生產(chǎn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制，優(yōu)化生產(chǎn)條件、提高載藥效率。同時(shí)可對(duì)EVs在生產(chǎn)后的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)估不同存儲(chǔ)條件對(duì)EVs的影響。NanoFCM的應(yīng)用貫穿整個(gè)EVs制劑研發(fā)、大規(guī)模生產(chǎn)、分離純化、質(zhì)控、穩(wěn)定性評(píng)估等整個(gè)過程，極大加速EVs產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程！