文章原創(chuàng)：屋中人 文章來源：生物屋 2024年11月25日 06:31 上海

01  酵母展示技術(shù)概述

1997年引入的基于酵母的展示方法是噬菌體和細(xì)菌展示的替代方法，與其他展示系統(tǒng)相比，酵母展示作為真核展示系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)在于其高效的翻譯后修飾(PTM)機(jī)制以及更好地適應(yīng)合成具有多個(gè)二硫鍵的復(fù)雜哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。通過與酵母細(xì)胞壁蛋白的融合，可以在酵母表面展示外源蛋白。酵母含有200nm厚的細(xì)胞壁，由β-聚糖、甘露蛋白和幾丁質(zhì)組成。酵母細(xì)胞壁的內(nèi)表面，通過幾丁質(zhì)連接β-1,3-葡聚糖微原纖維形成一個(gè)緊密的骨架層來阻止大分子的滲透，刷狀外表面由更多可溶性和支鏈的β-1,6-葡聚糖和甘露糖蛋白組成。在大多數(shù)酵母展示系統(tǒng)中，大多數(shù)展示在外細(xì)胞壁上的外源蛋白通過GPI與β-1,6-葡聚糖共價(jià)結(jié)合(糖基磷脂酰肌醇)錨定在它們的C末端。GPI錨定蛋白用于展示Agα1p、Aga2p、絮凝蛋白Flo1p、Cwp1p、Cwp2p、Sed1p、Tip1p、YCR89w和Tir1等異源蛋白。GPI錨定蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-高爾基分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到酵母細(xì)胞表面，并與細(xì)胞壁甘露蛋白層形成β-1,6-葡聚糖橋。

所謂酵母表面展示的抗體庫技術(shù)，就是將抗體分子與酵母膜表面分子融合表達(dá)，將抗體分子展示在酵母的膜表面，從而進(jìn)行快速篩選的技術(shù)。酵母的細(xì)胞壁由糖蛋白外層和葡聚糖內(nèi)骨架構(gòu)成，異源蛋白可以定位于糖蛋白層并與葡聚糖共價(jià)連接。根據(jù)目標(biāo)蛋白與酵母糖蛋白交聯(lián)的類型可以將酵母展示系統(tǒng)分成2種類型：α凝集素目標(biāo)蛋白和α表面凝集素目標(biāo)蛋白展示系統(tǒng)。

· α凝集素目標(biāo)蛋白展示系統(tǒng)是將目標(biāo)蛋白作為C端與α凝集素Aga2p亞基的N端融合，α凝集素由2個(gè)糖蛋白亞單位組成，即Aga1p和Aga2p，其中Aga1p亞單位通過β葡聚糖的的共價(jià)連接而錨定在細(xì)胞壁上；Aga2p亞單位通過2對(duì)二硫鍵與Aga1p相連，天然的α凝集素結(jié)合活性部位在Aga2p的C端，此部分可以用來展示外源蛋白(圖5-6)。Aga2p scFv融合蛋白的表達(dá)采用GAL1啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在葡萄糖培養(yǎng)基中受到抑制，在含有半乳糖的培養(yǎng)基中得到誘導(dǎo)，從而將scFv展示在細(xì)胞表面。

· α表面凝集素目標(biāo)蛋白展示系統(tǒng)是將目標(biāo)蛋白作為N端與α凝集素的C端融合，目標(biāo)蛋白經(jīng)過α凝集素展示在酵母細(xì)胞表面。α凝集素共價(jià)連接在細(xì)胞壁的葡聚糖上，其錨定能力由蛋白質(zhì)C端320個(gè)氨基酸組成，富含Ser/Thr殘基。Ser/Thr富集區(qū)因廣泛存在的O 糖基化而擁有一個(gè)桿狀構(gòu)象，可作為空間支撐物發(fā)揮作用。

雖然各種酵母菌株被用來展示各種蛋白質(zhì)和肽，但基于Saccharomyces cerevisiae Aga1p-Aga2p的酵母展示系統(tǒng)是最受歡迎的系統(tǒng)，可以從109個(gè)轉(zhuǎn)化子的大型文庫中分離出目標(biāo)特異分子。該方法的原理是基于外源蛋白與Aga2p蛋白融合的表達(dá)，Aga2p蛋白本身通過與α-凝集素Aga1p蛋白的兩個(gè)二硫橋固定在細(xì)胞膜上，這種附著在酵母表面形成共價(jià)復(fù)合物，外源蛋白和多肽可以融合到Aga2p的N端或C端，利用該系統(tǒng)，僅在一個(gè)酵母細(xì)胞表面就可以展示3×104個(gè)以上的異源蛋白分子。EBY100作為釀酒酵母工程菌株，可用于Aga1p-Aga2p酵母展示系統(tǒng)。在這種方法中，Aga2p融合蛋白編碼在工程質(zhì)粒中，而Aga1p編碼在酵母基因組中。兩者都在半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子(GAL1)的控制下表達(dá)，二硫鍵的形成確保了Aga1p和Aga2p蛋白的組裝。該結(jié)構(gòu)具有額外的標(biāo)記，包括所需蛋白的N端與Aga2p蛋白之間的血凝素標(biāo)簽(HA)和C端的c-Myc標(biāo)簽(圖1)。基于流式細(xì)胞儀的方法可以通過針對(duì)HA或c-Myc的特異性標(biāo)記抗體對(duì)這些標(biāo)簽進(jìn)行免疫熒光染色來確認(rèn)全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)。所需的蛋白可以在酵母Aga2p的C端或N端融合，也可以在Aga2p的C端和N端融合中展示兩種不同的蛋白(圖1)。

Flo1p作為一種凝集素樣蛋白是另一種細(xì)胞壁蛋白，通過結(jié)合細(xì)胞壁甘露聚糖在細(xì)胞絮凝中發(fā)揮著重要作用，也可用于酵母展示系統(tǒng)。Flo1p蛋白結(jié)構(gòu)由一個(gè)負(fù)責(zé)絮凝的結(jié)構(gòu)域、信號(hào)序列和GPI錨定結(jié)構(gòu)域組成，后者促進(jìn)了蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁的結(jié)合。在這兩種細(xì)胞的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了兩種嵌合蛋白的生產(chǎn)方法，F(xiàn)lo1p蛋白的壁固定結(jié)構(gòu)域：

1. 在含有Flo1p C端區(qū)域的GPI錨點(diǎn)的C端結(jié)合所需蛋白；
2. 利用Flo1p的絮凝作用域的粘附功能。同時(shí)，缺失Flo1p蛋白的GPI錨域被整合到嵌合蛋白中，導(dǎo)致在細(xì)胞表面顯示感興趣的無C端蛋白。

Pir家族細(xì)胞壁蛋白成員Pir2p/HSP150p/CCW7p、Pir1p/CCW6p、Pir4p/CCW5p/CCW11p/Cis3p和Pir3p/CCW8p在酵母展示中較少使用。Pir蛋白結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)細(xì)胞壁結(jié)合位點(diǎn)，而不是GPI錨點(diǎn)附著信號(hào)。

除了傳統(tǒng)的酵母表面展示外，還設(shè)計(jì)了一種改進(jìn)的Nbs篩選平臺(tái)。在這種方法中，Nb從其C端融合到Aga2p的N端，這種融合導(dǎo)致完全暴露的CDR抗原結(jié)合(圖2)。正交�；�載體蛋白(ACP)標(biāo)簽用于熒光團(tuán)(或生物素)的共價(jià)附著，可以監(jiān)測(cè)酵母表面表達(dá)Nb的展示水平。ACP標(biāo)簽包含一個(gè)獨(dú)特的保守絲氨酸殘基，可以與含有熒光團(tuán)或生物素的輔酶A(CoA)衍生物與Sfp合成酶共價(jià)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄受GAL1啟動(dòng)子控制，所展示的Nb可以很容易地通過其生物素標(biāo)簽固定在固體表面上釋放和分析。此外，ACP標(biāo)簽可以被其他替代品替代，如SNAP (pNSNAP載體)或S6 (pNS6載體)。

感興趣蛋白(POI)融合到α-凝集素Aga2p亞基的C端，兩側(cè)是c-Myc(綠色)和血凝素抗原(HA，紫色)標(biāo)簽。(B)兩個(gè)二硫鍵將725個(gè)氨基酸的凝集素Aga1p亞基連接到69個(gè)氨基酸的Aga2p亞基上。在細(xì)胞外空間，β1,6-葡聚糖將Aga1p與細(xì)胞壁共價(jià)連接，融合蛋白隨后分泌到細(xì)胞外空間。這將導(dǎo)致在單元表面顯示POI。(C)基于Aga1p-Aga2p的酵母顯示系統(tǒng)示意圖。a)顯示POI為C端與Aga2p蛋白的C端融合(灰色)，C端為c-Myc表位標(biāo)簽(綠色)，N端為HA標(biāo)簽(紫色)；b) N端融合并顯示POI, C端為c-Myc標(biāo)簽(綠色)，N端為HA標(biāo)簽(紫色)；c)兩種不同POI的N和C端融合共表達(dá)和展示。第一個(gè)POI(粉紅色)在C端(綠色)和N端(紫色)有c-Myc標(biāo)簽，而第二個(gè)POI(橙色)有Flag標(biāo)簽(紅色)。

酵母展示系統(tǒng)最大的優(yōu)勢(shì)是可以利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行高通量篩選，并且由于酵母的蛋白質(zhì)折疊和分泌機(jī)制與哺乳動(dòng)物細(xì)胞非常相似，對(duì)人抗體蛋白的表達(dá)和展示與噬菌體或細(xì)菌展示相比更具優(yōu)越性，酵母本身已在食品生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，安全性很好。但是酵母的轉(zhuǎn)化效率低，約為大腸桿菌的萬分之一，對(duì)于構(gòu)建大容量的抗體庫難度較大；酵母細(xì)胞的體積較大，表面抗原非常豐富，可能容易造成標(biāo)記蛋白與酵母表面分子的非特異性結(jié)合。酵母展示抗體庫為體外篩選有用抗體提供了一個(gè)新的方法，是對(duì)噬菌體抗體庫的有益補(bǔ)充。

02  抗體酵母展示

構(gòu)建酵母展示抗體文庫的基礎(chǔ)是將異質(zhì)免疫球蛋白基因庫克隆到酵母展示質(zhì)粒中，并將克隆的基因與Aga2p蛋白融合表達(dá)。通常，抗體片段結(jié)合在Aga2p蛋白的C端，但Nb結(jié)構(gòu)體除外。酵母展示系統(tǒng)中使用的大多數(shù)抗體格式是scFv；然而，包括Fab、納米體、單鏈Fab片段(scFab)和整個(gè)IgG在內(nèi)的其他抗體格式也可以在酵母表面顯示。GAL1啟動(dòng)子控制Aga1p的表達(dá)和Aga2p-Ab片段融合，酵母展示的抗體片段在半乳糖存在下融合到Aga2p的C端，針對(duì)c-Myc或HA標(biāo)記的免疫熒光標(biāo)記單抗用于監(jiān)測(cè)該組合復(fù)合物的表面密度變化。在酵母展示載體中插入抗體編碼基因，得到107-109個(gè)變異文庫。早期基于酵母展示的研究側(cè)重于現(xiàn)有抗體的親和成熟，而最近的研究則基于成功分離新生免疫球蛋白，磁活化細(xì)胞分選(MACS)和FACS用于酵母展示系統(tǒng)抗體的分離過程(圖3)。為了消除流式細(xì)胞術(shù)率的限制和增加FACS的選擇，非結(jié)合的mAb片段被MACS消除，MACS預(yù)選擇通過減少非反應(yīng)性背景來促進(jìn)FACS篩選。用c-Myc標(biāo)簽標(biāo)記用MACS系統(tǒng)選擇的酵母細(xì)胞，用于同時(shí)檢測(cè)scFv或Fab的表達(dá)。

03  酵母展示文庫構(gòu)建

• 同源重組

利用限制性酶切和基于連接的克隆技術(shù)構(gòu)建抗體基因庫，在酵母上展示以啟動(dòng)一抗分離或親和成熟。由于大多數(shù)酵母菌質(zhì)粒和酵母展示載體在大腸桿菌和酵母中的擴(kuò)增能力，因此基于連接的克隆利用大腸桿菌獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，最終的大腸桿菌純化產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化到酵母表達(dá)宿主中。利用真核生物同源重組的間隙修復(fù)機(jī)制來制備多種酵母基因文庫是另一種發(fā)展起來的技術(shù)，該方法采用PCR生成的抗體基因與表面展示受體載體共轉(zhuǎn)化的方法。一項(xiàng)研究證明了該方法的潛力，酵母展示和同源重組增加了抗肽單鏈抗體和抗蛋白單鏈抗體的親和力。

圖3. (A)通過FACS從酵母展示的Ab文庫中分離出高親和力蛋白變體。用Ab基因文庫轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并誘導(dǎo)其表面表達(dá)。在平移之前，所顯示的庫根據(jù)兩條主要路線進(jìn)行差異標(biāo)記：i)均衡綁定策略。在這種方法中，配體濃度比預(yù)期的最高親和力KD值高5-10倍，與文庫混合孵育；ii)動(dòng)力學(xué)結(jié)合策略。在這種方法中，配體如上所述，與文庫一起孵育，未結(jié)合的配體通過洗滌去除。此外，100倍多余的未標(biāo)記配體也被用來與該文庫孵育。(B) MACS的選擇示意圖或FACS的庫篩選示意圖。進(jìn)行細(xì)胞分選和擴(kuò)展的迭代輪，以豐富來自不同庫的稀有粘合劑。MACS恢復(fù)細(xì)胞擴(kuò)展為多輪FACS。

• 酵母雜交

為了開發(fā)治療性Fab片段，可以利用酵母雜交同時(shí)配對(duì)和擴(kuò)增展示文庫中的可變重鏈和輕鏈。不同的單倍體酵母可以通過不同的雜交方式表達(dá)VL和VH文庫，其中在兩株菌株的雜交中可以獲得109個(gè)多樣性的Fab文庫。在這種方法中，雖然其中一條鏈已連接到細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域，但另一條鏈必須表達(dá)為可溶性蛋白。

• 文庫的穩(wěn)定性

嚴(yán)格抑制基因和保持表達(dá)基因庫的多樣性是分離克隆的關(guān)鍵，一個(gè)文庫的不同克隆間毒性或生長(zhǎng)抑制水平的不同可能是由于組成型表達(dá)或漏表達(dá)的原因。因此，在選擇和篩選過程中，快速增長(zhǎng)的文庫成員將比增長(zhǎng)較慢的文庫成員具有優(yōu)勢(shì)。

04  酵母展示文庫的優(yōu)缺點(diǎn)

三種主要的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，包括噬菌體展示、細(xì)菌展示和酵母展示。在噬菌體展示系統(tǒng)中，異源蛋白通過附著在絲狀噬菌體的外殼蛋白上進(jìn)行展示。在該系統(tǒng)中，由于噬菌體體積小，所展示蛋白的大小受到限制，然而，可以通過同時(shí)表達(dá)野生型外殼蛋白和抗體融合外殼蛋白來規(guī)避這一問題。

在細(xì)菌展示系統(tǒng)中，由于將異源蛋白插入外膜蛋白的暴露環(huán)中，感興趣的蛋白在細(xì)菌細(xì)胞表面共同展示。然而，這種策略可能會(huì)導(dǎo)致外源蛋白的結(jié)構(gòu)破壞，從而降低細(xì)菌表面展示的效率，這些問題增加了開發(fā)真核顯示系統(tǒng)的需求。

酵母作為一種單細(xì)胞生物，依靠真核表達(dá)機(jī)制，熟悉翻譯后修飾來表達(dá)和折疊復(fù)雜的真核蛋白。然而，噬菌體和細(xì)菌展示系統(tǒng)中缺乏翻譯后系統(tǒng)和錯(cuò)誤折疊問題導(dǎo)致工程蛋白，特別是抗體的廣泛?jiǎn)栴}。在酵母表面錨定蛋白的C端或N端插入異源蛋白顯然不會(huì)破壞表面蛋白的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響表面展示的效率。此外，在酵母中，整個(gè)抗體的溶解度得到改善，因?yàn)檫@個(gè)宿主可以應(yīng)用類似于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)，如糖基化模式。此外，伴侶蛋白的存在有助于酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的精確折疊。酵母細(xì)胞在FACS中分選的相容性為大型組合表面展示文庫的生物物理表征和高通量篩選提供了良好的基礎(chǔ)。此外，無需亞克隆、可溶性表達(dá)和純化，就可以用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)單個(gè)變體進(jìn)行定量和生物物理表征。將酵母展示系統(tǒng)與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，并利用不同的標(biāo)記方法，包括平衡結(jié)合、動(dòng)態(tài)競(jìng)爭(zhēng)和有限靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)，可以充分和定量地區(qū)分與靶標(biāo)結(jié)合親和力略有不同的變異。然而，酵母顯示系統(tǒng)也有一些實(shí)際的缺點(diǎn)和局限性，第一個(gè)限制是它的庫較小(約107-109個(gè)個(gè)體克隆)，比基于噬菌體和細(xì)菌的展示系統(tǒng)獲得的庫大小低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在酵母展示系統(tǒng)中，由于酵母表面存在多個(gè)蛋白質(zhì)支架拷貝，低聚蛋白靶標(biāo)可能發(fā)生不希望的多價(jià)結(jié)合，這一限制導(dǎo)致分離出具有降低固有朗繆爾結(jié)合親和力的高親合性結(jié)合物。然而，使用動(dòng)能選擇可以避免這種限制。不同的文庫展示技術(shù)的比較見表2。

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