原創(chuàng) Mabioway 文章來源：邁博睿

抗體通過其互補決定區(qū) (CDR) 相互作用，從而賦予特定抗原的高度特異性�？贵w的經(jīng)典結(jié)構(gòu)由四條鏈組成：兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，每條鏈在可變區(qū)的末端含有三個 CDR。其中，重鏈的第三個 CDR 通常最為復(fù)雜，在基因水平上通過 V（可變）、D（多樣性）和 J（連接）基因的組合進行排列，這一過程稱為 VDJ 重組。此外，這些區(qū)域特別容易發(fā)生體細胞超突變，這可以進一步擴展序列空間以引發(fā)針對病原體的免疫反應(yīng)。當計算抗體序列空間的理論多樣性時，組合似乎是無限的。

用于治療目的的抗體的常用發(fā)現(xiàn)工具往往依賴于各種技術(shù)，但大致可分為體內(nèi)產(chǎn)生（例如動物免疫、雜交瘤或供體來源（例如 PBMC））或體外選擇（例如噬菌體和酵母展示）。當面對外來病原體時，B 細胞表面會顯示 1 型跨膜B 細胞受體，該受體通過 VDJ 重組作為親和力成熟的前體。典型的估計是，人類平均攜帶 1012–1015個抗體序列。然而，體外選擇的大小通常限制在 1010–1011，這仍然只是理論多樣性的一小部分。這些技術(shù)的對比在于，免疫理論上可以利用無限的多樣性，而體外文庫需要額外的工程和多輪選擇才能生成主要選定克隆的親和力成熟變體。

結(jié)構(gòu)生物學的最新進展促進了抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的發(fā)展，并為抗體-抗原相互作用提供了寶貴的見解。首先，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫目前已存儲超過 160,000 個結(jié)構(gòu)，其中近 4000 個結(jié)構(gòu)屬于抗體或抗體-抗原復(fù)合物。在原子水平上檢查共結(jié)晶結(jié)構(gòu)可以清楚地了解控制抗體-抗原相互作用的精確靜電力和疏水力。我們將利用這些原理描述掃描抗體-抗原界面以調(diào)節(jié)這種相互作用親和力的方法。

在沒有晶體結(jié)構(gòu)的情況下，可以使用基于同源性和從頭算結(jié)構(gòu)預(yù)測方法洞察復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但主鏈和/或側(cè)鏈構(gòu)象預(yù)測的不確定性可能導致親和力計算的不準確性。一般來說，模板和目標序列之間的序列同一性以及可用模板結(jié)構(gòu)的質(zhì)量是同源性建模中的重要考慮因素。同樣，從頭算結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果也受到方法、力場和接觸勢的選擇的影響。將結(jié)合所提供的示例討論將同源性建模納入結(jié)構(gòu)親和力計算的敏感性。例如，我們將重點關(guān)注已發(fā)表的 DX-2930 親和力成熟研究，DX-2930 是一種抗血漿激肽釋放酶的抗體，該藥物于 2018 年獲得商業(yè)批準，用于預(yù)防性治療遺傳性血管性水腫 。

有多種軟件包可用于執(zhí)行結(jié)構(gòu)建模和親和力計算，例如 MOE、BioLuminate 和 Rosetta。在本方法部分中，我們將重點介紹如何使用 MOE 。但是，許多一般原則都適用于這些不同的軟件平臺。

1、基于結(jié)構(gòu)的親和力成熟：一個實例
發(fā)現(xiàn)了一種抗血漿激肽釋放酶 (pKal) 的抗體 M0162-A04，其親和力為 5.39 nM。使用 VH-CDR3 內(nèi)的擺動文庫進行親和力成熟活動，其中每個核苷酸有 85% 的機會保留為親本，有 5% 的機會切換到其他三個核苷酸中的每一個。隨后對變異文庫進行噬菌體展示，產(chǎn)生了幾個相對于親本抗體具有改善親和力的克�。ū�1）。最終，克隆 M0199-A08 被選為最終候選藥物。M0199-A08（也稱為 DX-2930、lanadelumab）的晶體結(jié)構(gòu)已在 PDB 中公布，既有 Fab（4PUB），也有與 pKal（4OGX、4OGY）的共晶體 。作為本分析的起點，基于 4OGX 模板構(gòu)建了 M0162-A04 的同源性模型。如表1所示， M0162-A04 和 M0199-A08 之間的V H -CDR3中存在三處突變。此外，請注意，該示例旨在定義與抗原復(fù)合的整個抗體的殘基相互作用，但討論和分析將僅關(guān)注 V H -CDR3，因為已有關(guān)于該抗體的親和力成熟數(shù)據(jù)的公布。應(yīng)當注意，在本示例中，有些突變不會增加親和力。相反，這些突變對親和力要么有中性影響，要么有有害影響。

表 1 該表最初發(fā)表于《生物化學雜志》
 

表 2 各突變對 pKal 親和力總體變化倍數(shù)的影響總結(jié)

2、結(jié)果分析
表2總結(jié)了Kenniston 等人表1中的親和力數(shù)據(jù)，估計了每個氨基酸對親和力倍數(shù)變化的貢獻。一些突變具有很大程度的有效性，具體取決于序列中包含的其他突變。例如，表1中觀察到兩次 D110E 。在它的第一個實例中，在克隆 M0202-E03 中，它是唯一的突變，親和力從 5.39 nM 增加到 2.12 nM，代表有利的相互作用，增加了 2.5 倍。D110E 的第二個實例發(fā)生在 M0202-G03 中，現(xiàn)在它與 I103V 和 A108S 突變相結(jié)合，該克隆的親和力為 0.33 nM。然而，克隆 M0200-A10 僅包含 I103V 和 A108S 突變，其對 pKal 的親和力為 0.23 nM。這意味著，當直接比較 M0200-A10 和 M0202-G03 時，D110E 對相互作用略有不利影響。此處盡可能在單個突變的背景下估計倍數(shù)變化。因此，突變 D110E 被評為有利。一對突變 R99Q 和 D110N 無法與其他突變分離。這些突變中的每一個僅被選擇一次并出現(xiàn)在同一個克隆 (M0202-A12) 中。該克隆也可以直接與 M0200-A10 進行比較，并顯示出更好的親和力 (0.23–0.09 nM)；因此，這兩個點突變體的組合被認為是有利的，并且在本分析中，考慮它們的自由能總和，而不是它們各自的成分。

表2中的數(shù)據(jù)顯示，從定量角度來看，三種不同的殘基掃描設(shè)計方法表現(xiàn)相當一致，這意味著自由能的符號在所有三種方法中都處于同一方向。將 KD 值轉(zhuǎn)換為自由能變化后，我們發(fā)現(xiàn)計算的自由能變化量和實驗的自由能變化量之間沒有相關(guān)性。因此，我們只查看變化方向是否相同。大多數(shù)計算的自由能變化與測量的親和力變化相關(guān)，但有幾個明顯的例外：I103V 和 A108E。在這里，我們將分析這些殘基的預(yù)測，以及其他一些有趣的案例。

如本實驗描述所述，4OGX 的結(jié)晶復(fù)合物含有 I101、V103 和 E108。在進行殘基掃描之前，這些殘基分別通過同源建�；謴�(fù)突變?yōu)?T101、I103 和 A108。這些同源建模的殘基在三種殘基掃描方法中顯示出最大的自由能變化變化。例如，T101I 內(nèi)的突變都顯示出自由能的有利變化，與親和力的增加很好地相關(guān)。然而，低模式、動力學和旋轉(zhuǎn)體計算的值分別為 -1.76、-4.43 和 -0.55 kCal/mol，顯示出很大的變化。I103V 突變體在三種方法中的計算結(jié)果分別為 +2、+5.42 和 +2.99 kCal/mol。不幸的是，這是子集中最重要的突變之一，因為僅此突變就導致親和力增加了約 10 倍，從 5.39 nM 增加到 560 pM，因此此突變的 dAffinity 計算值非常正，這完全出乎意料。雖然 A108E 的變化幅度并不相同（親和力僅增加了兩倍），但計算結(jié)果還表明自由能變化的方向錯誤，三種計算方法的范圍在 1.3 到 1.8 kCal/mol 之間。

我們假設(shè)，與這些殘基的同源性建模相關(guān)的細微變化是造成這些樣品中自由能分布高度可變的原因，并且可以幫助解釋實驗觀察到的親和力變化與計算出的自由能值之間的差異。與更嚴格的自由能擾動方法相比，MMGBSA 方法的局限性也可能是另一個促成因素。第三，抗原中 CDR3 環(huán)和表位殘基的移動性可能無法在這些計算中完全捕獲。這些假設(shè)中的第一個很容易測試。我們準備了 4OGX 晶體結(jié)構(gòu)，并使用低模式 MD 簡單地執(zhí)行從 DX-2930 到 M0162-A04 的突變，以計算 I101T、V103I 和 E108A 的自由能變化。這三種突變都應(yīng)導致親和力降低，因此應(yīng)該對自由能產(chǎn)生正向變化。I101T (0.65 kCal/mol) 和 E108A (0.6 kCal/mol) 均同意這一假設(shè)，而 V103I (−0.3 kCal/mol) 實際上比使用同源模型殘基時更接近于零。圖1顯示 I103 模型更適合 pKal 殘基 478-480、Y555 和 W598 組成的口袋�？紤]到異亮氨酸上的額外甲基有助于增加范德華接觸，在這種情況下計算出的能量為 −0.3 kCal/mol 似乎是合理的。然而，親和力的急劇變化很難從生物物理和計算的角度來理解。

圖1 同源模型中的 I103（綠色）與 4OGX 中的 V103（紅色）的疊加

圖2 DX-2930 E108 與未最小化共晶體結(jié)構(gòu)中的血漿激肽釋放酶 K575 相互作用 ( a )。同源性建模和最小化后的抗體 A108 ( b )。轉(zhuǎn)換為 E108 后低模式 MD 分析的輸出構(gòu)象 ( c )。a 、b和c的疊加顯示，E108 和 K575 的天然相互作用被破壞，因為在這些模擬中 K575 的軌跡向 pKal 結(jié)構(gòu)回縮，從建模和最小化開始短暫，但在殘留掃描期間加速

盡管從親和力未成熟親本的同源模型重建 DX-2930 存在這些顯著的失敗，但這些數(shù)據(jù)中還是有幾個成功案例。在位置 103，Ala、Ser 和 Leu 是經(jīng)過改造的變體，旨在降低抗體對 pKal 的親和力，并且這些殘基中的每一個都顯示出強烈的正向自由能變化。然而，使用同源模型不利于自由能計算的邏輯，還使用 4OGX 晶體結(jié)構(gòu)中 V103 的低模式 MD 計算了這三個突變的 dAffinity。在這里，與殘基相關(guān)的自由能變化為 Ala +4.78 kCal/mol、Leu +1.12 kCal/mol 和 Ser +0.16 kCal/mol。此位置的丙氨酸將親和力降低至 228 nM，這與自由能的大幅變化很好地相關(guān)。同樣，L103 對應(yīng)的親和力略微下降至 12 nM，反映出突變后自由能略微增加。另一方面，絲氨酸的親和力變化最為劇烈（913 nM），但自由能計算并未反映出這一點，因為這種突變被認為在能量上與 V103 一致。

3、使用計算機計算生成庫
如本例所示，親和力成熟的輸入是描述兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)，然后進行計算機殘基掃描，從而輸出突變及其相關(guān)的結(jié)合自由能變化。對于上一節(jié)中描述的工作示例，小于零的自由能變化通常預(yù)示著有助于增加親和力的替換，而大于零的自由能變化通常表示突變降低了兩種蛋白質(zhì)的親和力。

下一個挑戰(zhàn)是評估計算機突變分析的輸出并生成一個要淘選的物理文庫，這需要了解文庫大小和淘選方法的限制。在上面描述的例子中，66 個 CDR 殘基中有 46 個與 pKal 接觸。按 dAffinity 排序，并取 -0.5 kCal/mol 的任意截止值，共有 233 個推定的突變，平均每個位點約有 5 個突變，不包括親本殘基（數(shù)據(jù)未顯示）�；�于這些近似值，理論文庫多樣性估計為 6 46，相當于 6.2 × 10 35的大小。鑒于典型噬菌體文庫的大小在 10 10的數(shù)量級，這個數(shù)字是天文數(shù)字，無法物理合成用于淘選，而且這個文庫的采樣將非常差。然而，在設(shè)計文庫時，其他考慮因素（例如預(yù)先選擇抗體-抗原界面或 CDR 上的較少位置、最大限度地利用種系殘基、可開發(fā)性以及消除潛在的化學降解傾向）可以大大減少計算設(shè)計文庫的理論大�。ㄉ院蠼榻B）。例如，使用一般對抗網(wǎng)絡(luò)設(shè)計的文庫能夠同時考慮可開發(fā)性和抗原結(jié)合。

此外，在計劃構(gòu)建親和力成熟文庫時，還應(yīng)考慮其他實驗策略。合成各種 DNA 寡核苷酸池已成為抗體親和力成熟的常用技術(shù)，并且在過去十年中，這些池的創(chuàng)建精度已大大提高。這些服務(wù)在大多數(shù) DNA 合成供應(yīng)商中很常見，不同的技術(shù)對單個 DNA 鏈合成精度的控制程度不同。對這些單個技術(shù)的評估超出了本章的范圍。為了更深入地探究理論上的多樣性，可以針對每個單獨的 CDR 構(gòu)建文庫以篩選親和力更高的結(jié)合物。此過程專門用于生成 DX-2930，如上例所示，其中文庫專門針對 VH - CDR3（盡管此例中的文庫是使用核苷酸序列的加權(quán)隨機化生成的，而不是受到計算機預(yù)測的影響）。盡管如此，為每個 CDR 和 CDR 組合（例如整條重鏈或整條輕鏈）創(chuàng)建文庫是篩選親和力增加的常用技術(shù)。這些單獨選擇的輸出可以與標準分子生物學過程相結(jié)合，并且可以生成一個新的文庫，其潛力甚至比單個組件文庫實現(xiàn)更高的親和力。

從另一個角度來看，可以通過限制某些殘基組合來降低文庫的復(fù)雜性，特別是那些可能導致假定缺陷的組合，例如氧化、脫酰胺、異構(gòu)化和糖基化。通過避免這些基序來減少理論多樣性有時可以大大減少搜索空間。本書、Thorsteinson 撰寫的一章以及文獻全面回顧了基于計算機的可開發(fā)性方法。最后，還可以通過對計算出的自由能變化設(shè)置更嚴格的過濾器來降低庫的復(fù)雜性。如果一個（或多個）CDR 具有大量與抗原相互作用的殘基，這可能尤為重要。相反，可以對僅與抗原形成幾個相互作用的 CDR 應(yīng)用較不嚴格的過濾器，從而在該區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生更大的多樣性。

文庫構(gòu)建是一門藝術(shù)和一門科學之間的平衡，沒有一種親和力成熟策略能夠廣泛涵蓋與改善抗體與其抗原之間的相互作用相關(guān)的理論多樣性。然而，我們希望本節(jié)能為采樣廣闊的序列空間提供一些合理的見解，以期提高抗體與其抗原之間的親和力。

4、未來方向
親和力成熟是優(yōu)化新發(fā)現(xiàn)的先導候選物過程中的一個重要步驟。該分析表明，科學家可以合理地定義突變集，以創(chuàng)建一個變體庫，這將有助于提高抗體-抗原相互作用的親和力。執(zhí)行此類任務(wù)的關(guān)鍵要求之一是抗體和抗原之間的共結(jié)晶復(fù)合物。正如本例中觀察到的，該方法的可靠性需要精確布局兩種蛋白質(zhì)之間的原子相互作用。可以使用同源性建模，但如果 CDR 中各個氨基酸的主鏈和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體構(gòu)象沒有精確定義，結(jié)果可能會變得不那么可靠。此外，目視檢查原子接觸可以幫助引導殘基并入庫中。

對于本章中的示例，在重新創(chuàng)建從 M0162-A04 親和力成熟庫中選擇的點突變時存在挑戰(zhàn)。當然，與在開始此練習之前模擬三個回復(fù)突變相比，擁有 M0162-A04 和血漿激肽釋放酶的共結(jié)晶復(fù)合物可能有助于闡明這兩種蛋白質(zhì)之間的接觸。特別是，導致親和力增加十倍的 I103V 突變可能仍然難以預(yù)測。然而，該方法表明，生成可以提高親和力的庫實際上是相當可行的，尤其是當引入其他在計算機中生成的能量有利突變時，但由于未在表1中列出，因此不屬于此分析的一部分。

由于該方法需要精確的分子相互作用來進行自由能計算，因此這一新興領(lǐng)域的未來方向很明確：抗體-抗原復(fù)合物預(yù)測的改進可以大大提高計算機計算的有效性，從而實現(xiàn)更好的庫設(shè)計。隨著結(jié)構(gòu)預(yù)測的改進，本章中的方法可以應(yīng)用于由抗體和抗原的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接同源性模型產(chǎn)生的預(yù)測抗體-抗原復(fù)合物，以生成計算機親和力成熟庫。