Biomarkers是進(jìn)行疾病篩查、預(yù)后和治療監(jiān)測的有效檢測指標(biāo)，其檢測通常依賴于高靈敏度和高特異性的功能性納米探針（例如標(biāo)記抗體或功能肽）。理想的功能性納米探針應(yīng)具有較高的結(jié)合親和力、較低的生產(chǎn)成本以及易于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和存儲等優(yōu)勢，這對于流行性疾病的快速篩查尤為重要。目前雖然已有多種策略可以將生物分子（如抗體）精確地附著到材料上以提高探針的靶向親和性，但仍存在偶聯(lián)效率低、位點特異性差和靶點結(jié)合效率低下等問題，功能性探針要實現(xiàn)廣泛的應(yīng)用仍然極具挑戰(zhàn)性。

來自澳大利亞昆士蘭大學(xué)的研究團(tuán)隊開發(fā)了一種高性價比且制作簡便的多功能納米探針模型，可用于疾病快速篩查，該成果發(fā)表在Nature Nanotechnology上。此研究團(tuán)隊將探針命名為synthetic bionanofragments (SynBioNFs)。SynBioNFs是基于工程化酵母菌衍生的合成生物納米片段，通過基因工程改造使其擁有多功能組分，包括內(nèi)源性的特定目標(biāo)結(jié)合劑（納米抗體）和通用表面粘合劑（粘附肽），研究證明SynBioNFs可在包括表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)、熒光、電化學(xué)、比色側(cè)向?qū)游?colorimetric lateral flow assay, LFA)等多種檢測平臺捕獲并檢測SARS-CoV-2病毒(SCV2)，其靈敏度可與金標(biāo)準(zhǔn)方法RT-qPCR相媲美。該探針模型能實現(xiàn)生物標(biāo)志物的高效檢測，有望應(yīng)用于大流行性疾病篩查。
 

一、SynBioNFs的結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)勢性能
SynBioNFs本質(zhì)是基因工程改造的酵母菌超聲破碎后的細(xì)胞壁碎片（納米探針顆粒）。SynBioNFs模型為以酵母菌細(xì)胞壁蛋白Aga2p為骨架，分別在N端和C端連接多功能蛋白/肽成分，超聲破碎后純化得到同時擁有特異性結(jié)合位點和通用的表面結(jié)合劑的納米探針Targeting binder-Aga2p (anchor protein)-Surface binder（圖1）。

與市售的生物標(biāo)志物檢測抗體相比，SynBioNFs包含酵母細(xì)胞壁中豐富的多糖羥基（能增強(qiáng)功能蛋白的穩(wěn)定性），在高溫、低pH和強(qiáng)洗滌劑條件下具有更高的穩(wěn)定性；同時得益于工程化的改造，SynBioNFs對目標(biāo)蛋白也表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和能力。因此，不管是從制備難易程度還是穩(wěn)定性、親和性等層面評估，SynBioNFs都具有優(yōu)良的生物標(biāo)志物檢測特性。

為驗證SynBioNFs在SCV2檢測中的功能，作者選用SCV2受體結(jié)合域(SCV2 receptor-binding-domain, SCV2 RBD)作為靶標(biāo)結(jié)合劑，MatterTags11、SpyTags和 StrepTags3種常見的功能肽作為表面結(jié)合劑，并結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)、電化學(xué)(Electrochemical)、熒光、比色等方法對SynBioNFs的診斷能力進(jìn)行評估，證明了SynBioNFs的精準(zhǔn)靶向性和在不同檢測平臺的通用性。
 

圖1. SynBioNFs設(shè)計技術(shù)路徑

二、SynBioNFs的制備和表征
將W25-MatterTag（靶標(biāo)結(jié)合劑）、Sb68-SpyTag（表面結(jié)合劑）分別連接在Aga2p（錨定蛋白）N端和C端制備重組質(zhì)粒后導(dǎo)入酵母菌。經(jīng)過培養(yǎng)的工程化酵母菌使用anti-myc-Dy650熒光抗體和SCV2 RBD–mNeonGreen進(jìn)行標(biāo)記，并利用流式細(xì)胞術(shù)對酵母細(xì)胞進(jìn)行鑒定（圖2），明確重組質(zhì)粒在酵母菌中高表達(dá)。而后超聲破壁處理酵母菌（對蛋白質(zhì)活性沒有不利影響），分離純化獲得SynBioNFs，使用納米流式（NanoFCM）對其粒徑分布進(jìn)行檢測（圖2 e, f），約為70 nm。

圖2. 流式對酵母菌蛋白表達(dá)圖譜(a,b,d,e)、NanoFCM對SynBioNFs的粒徑表征(c,f)

三、SynBioNFs捕獲納米探針
為了更好的為生物標(biāo)志物提供捕獲反應(yīng)界面和提高探針的檢測靈敏度，作者選用納米金作為SynBioNFs探針的載體平臺，將SynBioNFs固定在金微電極表面。作為捕獲探針，SynBioNFs（修飾W25-MatterTag作為表面結(jié)合劑）僅需10 min就能與金表面完全結(jié)合，這與W25-MatterTag輔助的可溶性蛋白固定在材料表面一致。
 

圖3. SynBioNFs（W25-MatterTag）在金表面的固定化

四、SynBioNFs檢測納米探針
SynBioNFs（修飾Sb68-SpyTag作為表面結(jié)合劑）可與SpyCatcher包被的金銀合金納米盒通過簡單的孵育完成自動組裝，偶聯(lián)產(chǎn)生用于讀取高度特異性和靈敏信號的檢測納米探針。為了驗證SpyTag和SpyCatcher在探針結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵作用，作者制備了不同的偶聯(lián)物組合，與RBD-mNeonGreen反應(yīng)后，通過NanoFCM檢測熒光信號強(qiáng)度以評估SynBioNFs作為生物探針的優(yōu)越性。結(jié)果顯示，Bioconjugate 1（同時含有SpyTag和SpyCatcher的生物偶聯(lián)物）的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其他組，這一結(jié)果表明了SpyTag和SpyCatcher這個偶聯(lián)結(jié)構(gòu)在SynBioNFs和納米盒連接過程中的必要性，使用SpyTag和SpyCatcher作為一種簡單和模塊化的生物偶聯(lián)方法，為納米探針生物功能化提供了一個潛在的有效策略。
 

圖4. SpyTag和SpyCatcher在SynBioNFs與金-銀合金納米盒結(jié)合探針中的作用

此外，為了驗證SynBioNFs與納米金-銀盒的組裝速率，作者利用NanoFCM檢測不同孵育時長制備的SynBioNFs（Sb68-SpyTag）金銀合金納米盒（包被SpyCatcher）生物偶聯(lián)物，發(fā)現(xiàn)孵育1 min即可實現(xiàn)85.8%組裝效率，孵育時間在10 min和30 min的組裝效率對比無顯著差異，即該偶聯(lián)系統(tǒng)可在10 min內(nèi)快速完成組裝。
 

圖5. NanoFCM對SynBioNFs與納米金-銀盒的不同時長組裝效果檢測

綜上，SynBioNFs在捕獲能力、熒光強(qiáng)度、組裝速度等方面均展現(xiàn)了顯著性的優(yōu)勢。緊接著作者使用SynBioNFs在SERS、熒光分析、比色法LFA等不同技術(shù)平臺驗證了其對SCV2病毒檢測的特異性和濃度敏感性，結(jié)果確認(rèn)了SynBioNFs與RBD對SCV2反應(yīng)的高特異性和低濃度響應(yīng)需求。SynBioNFs作為下一代納米探針，與市場上的傳統(tǒng)探針相比，具有低成本高效益且制造簡單的優(yōu)勢，在疾病診斷方面擁有非常廣闊的應(yīng)用前景。

NanoFCM展望
NanoFCM覆蓋傳統(tǒng)流式200 nm以下的檢測盲區(qū)，在生物納米探針的設(shè)計和研發(fā)過程監(jiān)測中具有顯著的優(yōu)勢：單次檢測即可獲得納米探針的粒徑、濃度等物理參數(shù)，同時還可基于NanoFCM的超高熒光靈敏度，快速檢測功能組分結(jié)合之后的熒光強(qiáng)度水平，進(jìn)一步優(yōu)化組分設(shè)計，提升探針的檢出靈敏度。當(dāng)然，NanoFCM還可基于熒光抗體或染料標(biāo)記策略驗證探針的組裝效率、甚至是構(gòu)建好的探針與待測病毒樣品的結(jié)合效率等，助力納米探針研發(fā)全流程，推進(jìn)納米探針在疾病診斷中的應(yīng)用。