在科學(xué)研究中，細胞遷移和侵襲是理解生物體內(nèi)許多重要過程的關(guān)鍵。本期文章深入探討了常用的檢測方法：細胞劃痕實驗和 Transwell 遷移/侵襲實驗。一起來看下吧~

我的"寶貝"細胞終于養(yǎng)好了，導(dǎo)兒說做遷移和侵襲試試，一頭霧水......

莫慌，遷移和侵襲可是大有不同！小 M 整理的這篇“干貨”涵蓋了基礎(chǔ)講解，實驗操作，以及常見問題解答，包會的！

01
遷移VS侵襲,大不同！

細胞遷移

細胞遷移 (又稱“細胞爬行、細胞移動或細胞運動”) 是細胞在接收到遷移信號或感受到其他物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞伸出頭部偽足并建立新的黏附，通過收縮細胞體尾部在時空上交替的過程。

遷移是活細胞普遍存在的一種運動形式，胚胎發(fā)育、傷口愈合、免疫應(yīng)答、組織重塑等重要生命活動過程都涉及細胞遷移^[1][2]。

圖 1. 細胞遷移的示意圖^[3]。 

細胞侵襲

細胞侵襲是入侵的細胞 (如癌細胞) 分泌蛋白酶降解胞外基質(zhì)層 (ECM) 或基底膜基質(zhì)層 (BME)，穿透基質(zhì)或組織進入血管和淋巴管，從一個區(qū)域侵入到另一個區(qū)域的過程。

侵襲常發(fā)生于癌細胞轉(zhuǎn)移等過程中，是細胞遷移的一種特殊形式^[2]。

Tips：

• 侵襲是腫瘤細胞及其微環(huán)境發(fā)生多種變化的累積結(jié)果，這些變化使細胞能夠遷移并侵入健康的宿主組織。
• 當(dāng)增殖的腫瘤細胞試圖逃離原發(fā)腫瘤部位時，必須發(fā)生局部細胞粘附和周圍組織的侵襲。在穿透血管內(nèi)皮并進入血流之前，癌細胞必須通過降解胞外基質(zhì)層 (ECM) 蛋白質(zhì)成分侵入局部組織，并最終穿過基底膜。一旦進入血液循環(huán)，這些細胞就可以在次要位置形成轉(zhuǎn)移性集落。

細胞遷移和侵襲都是細胞在環(huán)境中移動，依賴于細胞骨架的重組和細胞膜的動態(tài)變化，且受到細胞外信號 (如趨化因子、細胞因子等) 調(diào)控，與 ECM 的相互作用密切相關(guān)。但二者在機制、功能和意義方面有所區(qū)別。

表 1. 細胞遷移和細胞侵襲的不同比較^[4]。


 
02
細胞遷移檢測

細胞遷移實驗可以揭示遷移機制，用于藥物篩選與評估。廣泛應(yīng)用于癌癥研究、傷口愈合、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等多個領(lǐng)域。

細胞劃痕實驗和 Transwell 遷移實驗是檢測細胞遷移能力最常見的方法。

細胞劃痕實驗

一、細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗，又稱“傷口愈合實驗”，是一種經(jīng)典的檢測細胞遷移運動與修復(fù)能力的方法。

• 原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用槍頭或其它硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設(shè)定的時間，依據(jù)劃痕邊緣細胞逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕”愈合的能力，判斷細胞生長遷移能力^[5]。其可模擬傷口愈合過程，用于評估細胞在傷口處的遷移能力。

 
實驗材料

實驗前準(zhǔn)備：細胞、培養(yǎng)基、Transwell 小室或培養(yǎng)皿、劃痕工具 (無菌移液槍尖、劃痕刮刀或細胞劃痕器)、顯微鏡、合適的染色試劑 (如結(jié)晶紫或 DAPI)。

實驗步驟

(1) 細胞培養(yǎng)：將細胞以適宜的密度接種到培養(yǎng)皿或小室中進行培養(yǎng)，直到細胞生長到 80%-90% 匯合狀態(tài)。
(2) 劃痕制備：使用無菌移液槍頭或劃痕器在細胞單層上輕輕劃出一道直線或網(wǎng)格狀傷口，確�？梢孕纬删鶆虻膭澓�。在劃痕處，盡量避免損傷周圍細胞，以減少對數(shù)據(jù)的干擾。
(3) 清洗細胞：輕輕用 PBS 沖洗細胞兩次，以去除游離的、未附著的細胞。
(4) 更換培養(yǎng)基：更換新鮮的培養(yǎng)基，保持實驗條件的一致性。
(5) 觀察劃痕愈合：用顯微鏡拍攝劃痕的圖像，記錄初始劃痕的狀態(tài) (T0)，隨后在 0、12、24、48 小時等不同時間點拍照，觀察劃痕的寬度或遷移的細胞數(shù)。
(6) 數(shù)據(jù)分析：使用圖像分析軟件 (如 ImageJ) 分析拍攝的圖像，測量劃痕的寬度，計算愈合面積。

 
注意事項

• 劃痕：劃痕時確保寬度一致，形狀盡量規(guī)則。
• 對照組：設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ战M (如未處理組) 以便比對實驗結(jié)果。
• 顯微鏡觀察：定期拍照記錄，確保拍攝角度一致，以便于后期比較。

 
Transwell 遷移實驗

二、Transwell 遷移實驗

Transwell 遷移實驗，又稱“穿孔實驗”，是一種廣泛使用的細胞遷移實驗技術(shù)。

• 原理：將小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響^[9]。

圖 4. Transwell 遷移檢測的示意圖^[9]。 

 
實驗材料

實驗前準(zhǔn)備：Transwell 小室 (通常為 8 μm 的孔徑)、細胞、培養(yǎng)基、化學(xué)趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結(jié)晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。

實驗步驟

(1) 細胞培養(yǎng)：將細胞以適宜濃度接種于 Transwell 的上室中培養(yǎng)，直到細胞生長到 70%-80% 匯合。
(2) 準(zhǔn)備下室：在下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子 (如生長因子、細胞因子) 和培養(yǎng)基，建立化學(xué)梯度。
(3) 實驗設(shè)置：可以設(shè)置對照組 (無趨化因子) 與實驗組 (有趨化因子) 以比較細胞遷移能力的變化。
(4) 遷移實驗：將 Transwell 小室置于培養(yǎng)箱中，一般孵育 24-48 小時，具體時間視細胞系和實驗?zāi)康亩�定，以促使細胞向下室遷移。
(5) 清洗細胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，以去除未遷移的細胞。沖洗通常進行 2-3 次，減少背景噪聲。
(6) 固定細胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛固定細胞，常見的固定時間為 10-15 分鐘。固定結(jié)束后，用 PBS 沖洗細胞兩次，去除多余的固定液。
(7) 染色細胞：將染色劑 (如 0.1% 的結(jié)晶紫溶液) 加入 Transwell 的上室染色 20-30 分鐘。染色后，用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，以去除多余的染料。
(8) 觀察與計數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，然后拍攝圖像。選擇隨機區(qū)域計數(shù)遷移到膜底部的細胞。根據(jù)各組遷移的細胞數(shù)量進行比較，統(tǒng)計并計算遷移率。

圖 5. 人間充質(zhì)干細胞通過 Transwell 小室遷移^[8]。

 
注意事項

• Transwell 系統(tǒng)：選擇合適的透膜孔徑 (通常 8 或 12 μm) 或膜材料。
• 細胞狀態(tài)：確保細胞在對數(shù)生長期，以確�；盍Ω哌m合遷移。
• 操作輕柔：在沖洗和固定細胞時，操作應(yīng)輕柔，以避免損傷已遷移的細胞。時間選擇：不同細胞系的遷移能力不同，因此需根據(jù)具體細胞的特性調(diào)整實驗時間。

表 2. 劃痕實驗和 Transwell 遷移實驗的優(yōu)點和缺點。


02
細胞侵襲檢測

細胞侵襲實驗可用于研究細胞穿透基質(zhì)或組織的能力，細胞侵襲性、揭示侵襲機制、藥物篩選與評估，癌細胞轉(zhuǎn)移能力及細胞對環(huán)境變化的反應(yīng)。廣泛應(yīng)用于癌癥、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫反應(yīng)和再生醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。

Transwell 侵襲實驗是檢測細胞侵襲能力最常見的方法。

Transwell 侵襲實驗

三、Transwell 侵襲實驗

Transwell 侵襲實驗是一種廣泛用于評估細胞 (如腫瘤細胞) 侵襲能力的體外技術(shù)。

• 原理：與 Transwell 遷移實驗類似，但不同的是，聚碳酸酯膜的上表面需涂布一層類似基質(zhì)的材料 (如 Matrigel 或膠原蛋白) 以模擬細胞外基質(zhì)的環(huán)境，細胞會分泌酶類 (如基質(zhì)金屬蛋白酶, MMPs) 以降解基質(zhì)膠才能進入下室，計數(shù)進入下室的細胞即可反映細胞的侵襲能力^[10]。該實驗可了解細胞侵襲的調(diào)控機制，為相關(guān)疾病的治療提供依據(jù)。

圖 6. 細胞侵襲實驗的示意圖^[9]。

實驗材料

實驗前準(zhǔn)備：Transwell 小室 (通常 5 或 8 μm 孔徑)、基質(zhì)膠 (如 Matrigel 或膠原蛋白)、細胞系、培養(yǎng)基、化學(xué)趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結(jié)晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。 

實驗步驟

(1) 細胞培養(yǎng)：將細胞以適宜濃度接種培養(yǎng)皿中，確保細胞生長至 70%-80% 匯合。
(2) 準(zhǔn)備基質(zhì)膠：根據(jù)廠家的說明書，在冰上將所需量的基質(zhì)膠 (Matrigel 或膠原蛋白) 溶解。在 Transwell 上室底部涂抹必要厚度的基質(zhì)膠 (通常為 50-100 μL)。在 4℃ 下孵育約 30 分鐘- 1 小時，以確保基質(zhì)膠固化。
(3) 準(zhǔn)備下室：在 Transwell 下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子 (如生長因子、細胞因子) 和培養(yǎng)基。
(4) 遷移實驗：將細胞 (通常為 1-2×10⁵ 個細胞) 懸浮于適宜的培養(yǎng)基中，并添加到 Transwell 上室中。在培養(yǎng)箱中孵育 24-48 小時，具體時間視細胞系和實驗?zāi)康亩�定，細胞則向下室遷移和侵襲。
(5) 清洗細胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，去除未侵襲的細胞。沖洗通常進行 2-3 次，減少背景噪聲。
(6) 固定細胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛在 Transwell 上室中固定細胞，固定時間 10-15 分鐘。固定結(jié)束后，用 PBS 沖洗細胞 2 次，去除多余的固定液。
(7) 染色細胞：將染色劑 (如 0.1% 結(jié)晶紫溶液) 加入 Transwell 上室染色 20-30 分鐘。用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，去除多余的染料。
(8) 觀察與計數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，拍攝圖像。并選擇隨機區(qū)域計數(shù)侵襲到膜底部的細胞。根據(jù)各組侵襲的細胞數(shù)量進行比較，統(tǒng)計并計算侵襲率。
 

圖 7. Transwell 侵襲實驗中 Rac1 siRNA 抑制 SNB19 細胞通過 Matrigel 的侵襲^[11]。 

 
注意事項

• 基質(zhì)膠的處理：基質(zhì)膠需在冰上處理，以保持其生物活性；鋪膠時，盡量垂直小室底部在小室底部中間加入，避免產(chǎn)生氣泡。
• 細胞狀態(tài)：確保細胞在對數(shù)生長期，以確�；盍Ω哌m合侵襲。
• 輕柔操作：在沖洗和固定細胞時，操作應(yīng)輕柔，避免損傷已侵襲的細胞。
• 觀察時間選擇：不同細胞系的侵襲能力不同，根據(jù)具體細胞的特性和對實驗的預(yù)期效果調(diào)整實驗時間。

 
03
常見問題及解答

▐ 為何實驗中細胞遷移不足？
答：可能的原因包括細胞狀態(tài)不處于健康生長期、培養(yǎng)條件不具有適宜的培養(yǎng)基和生長因子、基質(zhì)的厚度和成分不適合研究細胞遷移、實驗環(huán)境不利于細胞遷移、孵育時間不充分等。
▐  為什么細胞在 Transwell 實驗中不能通過基質(zhì)？
答：可能的原因包括選擇的膜孔徑偏小、基質(zhì)膠或 Matrigel 的濃度過高、產(chǎn)生氣泡、缺少促進細胞侵襲的生長因子或細胞因子、細胞傳代次數(shù)太多失去遷移活性、細胞系不適合等。
▐ 實驗過程中如何減少背景噪聲？
答：實驗后使用PBS徹底沖洗、使用適當(dāng)濃度的染料并控制染色時間、在固定和沖洗細胞時避免損傷細胞等。
▐ 如何選擇合適的細胞系進行遷移和侵襲實驗？
 
表 3. 不同細胞系對 Transwell 小室孔徑的選擇。

▐ 染色后細胞分布不均一可能原因？
答：Transwell 小室未平衡放置于孔板中、細胞懸液未混勻、小室發(fā)生傾斜或晃動、小室的滲透膜不平等。
▐ Transwell 小室接種細胞的加液順序是什么？
答：先將完全培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿或孔板中 (下室)，再輕輕將小室放入下室中。在放入時，建議將小室稍稍傾斜，一側(cè)先接觸液面，避免垂直放入產(chǎn)生氣泡。之后將混合均勻的細胞懸液加入小室內(nèi)部。
 

產(chǎn)品推薦

Basement Membrane Matrix (HY-K6002) 基底膜基質(zhì)膠 (無酚紅)

Basement Membrane Matrix (Phenol Red) (HY-K6001) 基底膜基質(zhì)膠 (含酚紅)

Crystal Violet (HY-B0324A) 堿性染料，可以將細胞核中的 DNA 染為深紫色

Giemsa stain (HY-D0944) 可染色染色質(zhì)和核膜

DAPI dihydrochloride (HY-D0814) 一種 DAPI 染料

 
參考文獻：
[1] Vicente-Manzanares M, et al. Cell migration: an overview. Methods Mol Biol. 2011;769:1-24. 
[2] Sahai E. Mechanisms of cancer cell invasion. Curr Opin Genet Dev. 2005 Feb;15(1):87-96. 
[3] Ananthakrishnan R, et al. The forces behind cell movement. Int J Biol Sci. 2007 Jun 1;3(5):303-17. 
[4] Bozzuto G, et al. Molecular aspects of tumor cell migration and invasion. Ann Ist Super Sanita. 2010;46(1):66-80.
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[6] Hulkower KI, et al. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 2011 Mar 11;3(1):107-24. 
[7] Pijuan J, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.
[8] Rüster B,et al. Induction and detection of human mesenchymal stem cell migration in the 48-well reusable transwell assay. Stem Cells Dev. 2005 Apr;14(2):231-5. 
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