利用短波紅外拉曼散射實現(xiàn)宏觀無標記的生物醫(yī)學成像
本文要點：短波紅外 （SWIR） 成像可在臨床和臨床前應用中增強生物組織穿透深度并減少自發(fā)熒光。然而，現(xiàn)有應用通常無法在沒有造影劑的情況下探測化學成分和分子特異性的能力。作者提出了一種 SWIR 成像方法，該方法可以在大視場中可視化組織深處的自發(fā)拉曼散射，并表現(xiàn)出明顯的化學對比度。本文的結(jié)果表明，拉曼散射有效地解決了自發(fā)熒光在短至 892 nm 的照明波長下造成內(nèi)源性組織背景較高的問題。通過體內(nèi)監(jiān)測全身組織成分動力學和無創(chuàng)檢測小鼠脂肪肝疾病，以及鑒定未固定的人動脈粥樣硬化斑塊中的鈣化和脂質(zhì)，展示了 SWIR 拉曼成像的多功能性。此外，該方法有助于可視化嵌入到脂肪組織中的神經(jīng)，這是外科應用的重大進步。SWIR 拉曼成像采用與熒光正交的簡單寬場設(shè)置，有望被臨床醫(yī)生和生物學家迅速采用。這項技術(shù)為全動物病理生理學的無造影劑可視化和人類術(shù)中成像開辟了新的可能性。
本文利用 SWIR 成像來實現(xiàn)大視野組織深處的自發(fā)拉曼散射可視化。通過使用 892 至 1064 nm 之間的照明波長，克服了以前生物組織自發(fā)拉曼成像中的自發(fā)熒光限制，并提供了優(yōu)異的化學對比度。為了證明 SWIR 拉曼成像的強大功能，作者展示了其無創(chuàng)監(jiān)測小鼠模型和人體組織中動態(tài)生理和病理組織重塑的能力。
圖1. 寬視場宏觀 SWIR 拉曼成像系統(tǒng)設(shè)計、體外驗證和初步生物學演示
為了在 SWIR 光譜區(qū)域?qū)暧^自發(fā)拉曼散射進行成像，作者設(shè)計了一個簡單的成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)由類似于檢測 SWIR 熒光的組件組成。拉曼成像是通過用特定波長漫射照射樣品并用窄帶通濾光片過濾散射光來實現(xiàn)的（圖 1 a ）。這些濾光片選擇性地捕獲與感興趣的拉曼位移相對應的散射波長，這些波長被確定為照明波長和對應于特定鍵能量位移的波長的組合。
基于新啟用的在大視場中可視化拉曼散射的能力，作者研究了完整小鼠體內(nèi)生物組織的全身化學對比。脂肪組織脂肪庫和位于胸骨下方的劍突軟骨在 CH 區(qū)的完整皮膚中表現(xiàn)出強烈的對比度，而 OH 波段的信號分布在整個身體中（圖 1 d ）。此外，皮下淋巴結(jié)和脂肪組織脂肪庫根據(jù)它們的相對水分和脂質(zhì)含量清晰可辨，由它們各自的 OH 和 CH 拉曼強度決定。這種化學對比與背景自發(fā)熒光明顯不同。
此外，SWIR 拉曼成像能夠通過人體皮膚實現(xiàn)化學對比的可視化。通過 CH 拉曼信號觀察了手和手指背表面的皮下脂肪墊， OH 拉曼帶則突出了伸肌腱和相鄰的手背骨間�。▓D 1 e-f ）。值得注意的是，在皮下血管下觀察到脂肪墊和肌腱的拉曼對比，這產(chǎn)生了負對比，尤其是在 CH 區(qū)域。相比之下，自發(fā)熒光主要表現(xiàn)在皮膚表面的皺紋中。
這些初步發(fā)現(xiàn)突出了 SWIR 拉曼成像的能力，即在大于 50 cm 的視場內(nèi)，根據(jù)皮膚的化學對比無創(chuàng)識別生物組織，無需使用造影劑。
圖2. 在照明波長等于或高于 892 nm 的寬場成像中，拉曼散射是組織背景的主要來源
為了了解不同照明波長對組織化學對比度的影響并確定其優(yōu)點和局限性，作者從完整小鼠身上獲取了 SWIR 拉曼圖像，照明波長從 785 nm（拉曼成像中常用的波長）到 1064 nm（紅移波長，將拉曼散射波長延伸到標準 InGaAs 探測器的極限之外）。研究結(jié)果表明，一旦照明波長達到 892 nm，化學對比度（特別是脂肪組織脂肪庫中 CH 區(qū)域的化學對比度）就會變得比自發(fā)熒光更強，并繼續(xù)上升到 1064 nm（圖 2 a-d）。即使使用長通濾光片在同一幀內(nèi)捕獲拉曼靜默區(qū)域，這種基于拉曼的對比度增加也是顯而易見的，突出表明，即使在非特定的寬成像帶內(nèi)，較長照明下化學對比度的增強也能有效克服自發(fā)熒光。然而，較長的波長需要較慢的成像幀速率，需要根據(jù)特定的應用要求平衡對比度和采集速度。
圖3. 小鼠病理生理學中化學造影劑的無創(chuàng)體內(nèi) SWIR 拉曼成像
隨后，作者探索了 SWIR 拉曼成像在臨床前小鼠模型中全身水平身體成分非侵入性可視化的應用。最初，為了檢測脂肪組織表型，對遺傳性肥胖小鼠 （ob/ob） 進行了成像，由于缺乏飽腹感激素瘦素，與年齡匹配的對照相比，體重增加多達三倍。拉曼 CH 區(qū)域?qū)Ρ韧怀隽怂麄內(nèi)碇窘M織脂肪庫的豐度（圖 3 a）。
接下來，作者評估了 SWIR 拉曼成像在肝脂肪變性無創(chuàng)化學造影劑檢測中的潛力，對小鼠進行宏觀 SWIR 拉曼成像。通過完整的皮膚，檢測到喂食 MCD 飲食的小鼠肝臟中的拉曼 CH 強度高于喂食正常飲食的同窩小鼠（圖 3 b-d）。這些發(fā)現(xiàn)證明了 SWIR 拉曼成像作為 MASLD 等疾病進展過程中組織成分變化的全身、無創(chuàng)監(jiān)測的寶貴工具的潛力。
轉(zhuǎn)向體內(nèi)應用后，作者利用 SWIR 拉曼成像縱向監(jiān)測活體小鼠的組織動力學，展示了其無創(chuàng)和無標記的特性。系統(tǒng)跟蹤禁食的小鼠體內(nèi)身體成分變化的能力，觀察到禁食 24 小時后脂肪組織中散射的拉曼 CH 區(qū)強烈減少，這在再進食后 48 小時內(nèi)逆轉(zhuǎn)（圖 3 e ）。
圖4. SWIR 拉曼成像用于對小鼠和人類未固定樣品中的組織成分進行離體分析
本文研究了 SWIR 拉曼光譜儀在測量未固定組織中脂質(zhì)含量的應用，這將能夠進行直接組織分析，同時保持其天然和完整的成分。事實上，作者在會誘導肥胖和肝脂肪變性的高脂肪飲食（圖4）的野生型小鼠的肝臟中觀察到更強的 CH 強度，表明脂質(zhì)含量較高。
采用 SWIR 拉曼成像來可視化未固定的人類斑塊中的異質(zhì)組織成分。利用在外翻血栓動脈內(nèi)膜切除術(shù)期間從患者獲得的頸動脈或股動脈切除的動脈粥樣硬化組織，靶向 PO4-3960 cm-1 處的拉曼峰檢測動脈粥樣硬化斑塊鈣化，CH 區(qū)檢測脂質(zhì)。值得注意的是，觀察到斑塊內(nèi)顯示鈣化或大量脂質(zhì)含量的不同結(jié)構(gòu)域，無需進行組織處理，例如固定、脫鈣、切片和染色（圖 4 d-e）。通過比較采用固定和脫鈣方案前后的成像結(jié)果來驗證拉曼造影劑對鈣化的特異性。該方案消除了 PO4-3信號并降低 CH 強度（圖 4 f-g ）。
圖5. 使用 SWIR 拉曼成像對豬手術(shù)模型脂肪組織的神經(jīng)進行鑒定
雖然神經(jīng)可以在視覺上與肌肉組織區(qū)分開來，但當它們嵌入脂肪組織中時，它們在可見光下的識別變得非常困難（圖 5 a）。本文采用 SWIR 拉曼成像來可視化豬模型中的面神經(jīng)。、結(jié)果顯示，基于拉曼成像，脂肪組織內(nèi)存在強烈的神經(jīng)對比（圖 5 b-c ）。最重要的是，SWIR 拉曼成像能夠揭示在可見光下不可見的隱藏結(jié)構(gòu)。盡管血管中存在可以肉眼識別的 OH 信號，但研究結(jié)果表明 SWIR 拉曼成像在術(shù)中環(huán)境中的潛力。通過利用無標記化學造影劑，它無需外源性造影劑即可實現(xiàn)神經(jīng)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的可視化。
在這項工作中，作者推出了一種新穎的基于拉曼散射的成像方法，該方法能夠在單幀中實現(xiàn)高化學對比度，而無需自發(fā)熒光減法或光譜解混，視野超過 50 cm2，實現(xiàn)新的生物醫(yī)學應用.研究結(jié)果表明，當組織用 892 或更長的波長照射時，基于拉曼散射的化學對比克服了自發(fā)熒光。這表明寬場拉曼成像應利用這些波長來獲得最佳化學對比度，因此需要 SWIR 拉曼散射檢測。除了自發(fā)熒光抑制之外，SWIR 拉曼成像還利用了該波長范圍固有的光學優(yōu)勢，例如更深的組織穿透、更強的成像對比度和更高的分辨率。本研究的結(jié)果在 892 nm 照明下每幀 10 秒曝光內(nèi)顯示出明顯的化學對比和高信噪比。采用目前正在開發(fā)的更大、更靈敏的 SWIR 探測器，將實現(xiàn)更高的信噪比和更短的曝光時間。
總之，SWIR 拉曼成像不僅將拉曼成像的應用擴展到宏觀尺度，而且擴展了生物醫(yī)學成像的整體能力。通過與傳統(tǒng)熒光成像保持正交，這種簡單的方法支持多模式策略，從而為臨床前和臨床應用開辟了新的途徑。在手術(shù)環(huán)境中，它的使用有望通過實現(xiàn)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)（例如隱藏在脂肪組織中的神經(jīng)）的可視化而帶來立竿見影的好處，從而解決當今接受手術(shù)的患者面臨的主要風險。
參考文獻
Arus B A, Yiu J, Lingg J G P, et al. Macroscopic label-free biomedical imaging with shortwave infrared Raman scattering[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 10.597863.
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