多色流式細胞術該進行配色的方法與技巧介紹
流式細胞術是一種利用流式細胞儀對快速流動的細胞或顆粒進行多參數分析的技術，能夠對細胞表面和內部的蛋白質、DNA、RNA等進行定量檢測和分類，同時可實現(xiàn)細胞的分選。
流式抗體（FACS Antibody）是專為流式細胞術設計的抗體，用于檢測和分析細胞表面或內部的特定蛋白質。這些抗體通常帶有熒光標記，流式細胞儀通過檢測其發(fā)出的熒光信號來識別并分析細胞特征（如圖1）。流式細胞術可使用直接標記（如FITC、PE、APC等）的抗體進行檢測，或通過未標記抗體進行間接檢測。
流式抗體的特點：
1）熒光標記：流式抗體通常結合熒光染料，如FITC、PE、APC 等，便于在流式細胞儀中檢測目標抗原的表達水平。
2）高特異性和親和力：抗體需對目標抗原高度特異，以確保流式檢測中的精確性。
3）低非特異性結合：流式抗體通常經過優(yōu)化，以減少非特異性結合，提高信噪比。
4）穩(wěn)定性：流式抗體的熒光標記物應在實驗條件下具有較高的穩(wěn)定性，以保證信號不受環(huán)境光和樣品處理的影響。
流式抗體的類型：
1）單克隆抗體：針對單一抗原表位，提供一致性高、特異性強的信號，是流式細胞術中的首選。
2）多克隆抗體：識別抗原的多個表位，信號強度較高，但特異性較單克隆抗體低，通常在特定應用中使用。
3）直接標記抗體：抗體直接結合熒光染料，用于單一染色，便于操作，信噪比較高。
4）間接標記抗體：使用未標記的抗體加上熒光標記的二抗，用于增加信號強度或在稀有抗體不足的情況下應用。
5）異型對照抗體：用作陰性對照，以確保信號特異性，排除非特異性結合的影響。
流式抗體的選擇：
1）抗體的特異性和親和力：根據目標抗原，選擇已驗證具有良好特異性和親和力的抗體，以確保檢測的準確性。
2）熒光染料的選擇：根據多重染色實驗的要求選擇不同光譜的熒光染料，避免光譜重疊并優(yōu)化信號檢測。
3）抗體來源：選擇與實驗物種匹配的抗體來源，以減少交叉反應。
4）直接或間接標記：對于高表達抗原，直接標記抗體更簡便；對于低表達抗原，間接標記抗體可提高信號。
5）適當的對照：包括異型對照、未染色對照、單染色對照等，以校正信號背景和優(yōu)化數據分析。
6）選擇合適的流式抗體能夠顯著提高實驗的特異性、信噪比和數據準確性。
多色流式細胞術該如何進行配色？
流式細胞實驗表面上是一個非常簡單的試驗，但是對于大多數新手來說，除了要慎重選擇抗體之外，還要熟悉如何進行熒光配色，最大限度地減少對補償和重疊的調整，這也是流式實驗的重中之重。
大部分科研工作者對流式的應用還局限于四色以內分析，對于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合適，導致各染料之間干擾很大，結果很難分析。本文總結了流式多色染色熒光搭配的幾點技巧以供參考：
技巧1：選擇合適的目標 Marker并確定Marker 的表達位置
通過查閱相關文獻，在試驗之前需要確定好Marker以及Marker 之間的邏輯關系（圈門的父子關系，比如 T 細胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。
對于細胞質或者細胞核的 Marker，需要對細胞進行固定破膜/破核膜。在做胞質或胞核 Marker 染色實驗操作時，需要先染細胞表面 Marker，再對細胞進行固定破膜，最后對胞內或核內 Marker 染色。
一般來說，絕大部分 CD 分子指標，都是細胞表面指標；IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，屬于胞內指標；而最常見的核內染色指標是 Foxp3（如表）
技巧2：選擇流式細胞儀能檢測的染料
要充分了解流式細胞儀有哪些激光器，有哪些濾光片通道，充分利用儀器允許的全部熒光染料，盡量選用多激光激發(fā)。
如圖2列出了流式細胞儀的激發(fā)器和每個激發(fā)器對應能檢測的染料[1]。下圖只是列出了每個激發(fā)器可能激發(fā)的染料，并未列出所有染料，并不是儀器配置了該激發(fā)器就一定能激發(fā)出對應的染料，還需要根據儀器的通道配置來選擇，即每個激發(fā)器對應有哪些檢測通道，而每個檢測通道只能對應檢測一種染料，但不同染料可能是由同一個檢測通道來檢測，那么這些染料我們稱之為熒光對等染料，熒光對等染料是不能共用的。
技巧3.強弱互補
熒光染料亮度有強弱之分，抗原表達有高低區(qū)別，因此弱表達抗原應該選擇強熒光染料，強表達抗原選擇弱熒光染料，使染料的亮度與抗原密度匹配。通常，根據待測細胞類型中，相應抗原的表達量，可以粗略地將抗原分子分為三類[2]：
1）很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽性細胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。
2）很容易鑒定、較高水平表達、經常連續(xù)性表達。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
3）低水平表達、激活性 Marker、未知但關鍵。例如：CD25，STAT5，F(xiàn)oxp3 等。
同樣，弱表達抗原放在被干擾較小的檢測通道，而強表達抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測時，弱表達抗原應該搭配APC熒光染料標記的抗體；強表達的抗原最終染色的信號較強，容易對其他檢測通道造成干擾，因此我們應該選擇對其他通道干擾較小的熒光染料。
因抗原表達密度受細胞類型以及細胞活化程度的影響，所以在此無法詳細列出各抗原的表達密度強弱。但熒光染料的強弱是固定的，熒光的強度與染色指數(Stain Index)有關，一般染色指數越高，熒光強度越好；染色指數較低，染色強度相對較差，通過染色指數可以直接比較出各個熒光染料的強度（如圖3）。
技巧4：表達互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道，共表達的抗原避免放在相互干擾的通道
表達相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會同時表達在一種細胞上，這兩種抗原表達在兩種細胞上（例如CD4和CD8），因此流式圖上分群很明顯，即使熒光染料之間干擾很大，也很容易通過補償的調節(jié)避免干擾；
而共表達的抗原指的是這兩種抗原表達在同一種細胞上（例如CD4和CD25），在流式圖上我們是要分析雙陽性的細胞比例，因此如果這兩個抗體對應的熒光染料之間有干擾，則會對圈門結果造成干擾，影響分析的細胞比例。
當然，選擇優(yōu)質的特異性抗體是實驗成功的根本保證。在設計多色流式 panel 時，重要的是要了解儀器的配置，以及如何最佳地組合多種熒光染料，以最大程度地減少光譜重疊、提高結果的準確性。
TargetMol 可為您提供多種靶點的流式抗體，可用于流式細胞熒光分選技術（FACS）、 ELISA、免疫印跡試驗（Western Blot, WB）和免疫熒光(Immunofluorescence, IF)等多種實驗。
TargetMol流式抗體產品
目前，TargetMol 可提供超過 2350+ 種流式抗體產品，覆蓋了多種不同靶點、不同宿主，不同熒光標記的特異性檢測一抗。我們的產品以溶液形式提供，操作簡單方便。產品本身有嚴格的質控、高批次間一致性、高純度和高親和力；能夠滿足多種不同檢測靶點對于流式抗體的特異性和靈敏度要求。
TargetMol流式抗體產品優(yōu)勢
哺乳動物表達系統(tǒng)：
我們的抗原使用哺乳動物表達系統(tǒng)，能最大限度保留人源蛋白天然結構、功能以及翻譯后修飾。
兔源單克隆重組抗體：
我們的抗體使用兔子為免疫載體，兔子具有成熟的免疫機制并且與人同源性低。兔源抗體具有親和力強、靈敏度高、特異性強、多樣性豐富等特點。此外，重組抗體的制備批次間差異小。
高穩(wěn)定性：
產品均通過凍融穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性測試，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
高覆蓋度、多表位、多標記：
針對370+種人源蛋白兔單抗，每種抗原可提供多個潛在不同表位的抗體，系列抗體可以間接標記多種熒光蛋白（APC、PE等）或熒光小分子（AF488、AF555、AF647等）。
產品驗證數據：
Flow cytometry on MV4-11 using anti CD47 (red) rabbit mAb and goat anti-rabbit IgG (H+L), BV405,control cells were stained only with BV405 (Blue)
參考資料：
[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973.
[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.
流式抗體（FACS Antibody）是專為流式細胞術設計的抗體，用于檢測和分析細胞表面或內部的特定蛋白質。這些抗體通常帶有熒光標記，流式細胞儀通過檢測其發(fā)出的熒光信號來識別并分析細胞特征（如圖1）。流式細胞術可使用直接標記（如FITC、PE、APC等）的抗體進行檢測，或通過未標記抗體進行間接檢測。
▲圖1：流式抗體的工作原理示意圖
流式抗體的特點：
1）熒光標記：流式抗體通常結合熒光染料，如FITC、PE、APC 等，便于在流式細胞儀中檢測目標抗原的表達水平。
2）高特異性和親和力：抗體需對目標抗原高度特異，以確保流式檢測中的精確性。
3）低非特異性結合：流式抗體通常經過優(yōu)化，以減少非特異性結合，提高信噪比。
4）穩(wěn)定性：流式抗體的熒光標記物應在實驗條件下具有較高的穩(wěn)定性，以保證信號不受環(huán)境光和樣品處理的影響。
流式抗體的類型：
1）單克隆抗體：針對單一抗原表位，提供一致性高、特異性強的信號，是流式細胞術中的首選。
2）多克隆抗體：識別抗原的多個表位，信號強度較高，但特異性較單克隆抗體低，通常在特定應用中使用。
3）直接標記抗體：抗體直接結合熒光染料，用于單一染色，便于操作，信噪比較高。
4）間接標記抗體：使用未標記的抗體加上熒光標記的二抗，用于增加信號強度或在稀有抗體不足的情況下應用。
5）異型對照抗體：用作陰性對照，以確保信號特異性，排除非特異性結合的影響。
流式抗體的選擇：
1）抗體的特異性和親和力：根據目標抗原，選擇已驗證具有良好特異性和親和力的抗體，以確保檢測的準確性。
2）熒光染料的選擇：根據多重染色實驗的要求選擇不同光譜的熒光染料，避免光譜重疊并優(yōu)化信號檢測。
3）抗體來源：選擇與實驗物種匹配的抗體來源，以減少交叉反應。
4）直接或間接標記：對于高表達抗原，直接標記抗體更簡便；對于低表達抗原，間接標記抗體可提高信號。
5）適當的對照：包括異型對照、未染色對照、單染色對照等，以校正信號背景和優(yōu)化數據分析。
6）選擇合適的流式抗體能夠顯著提高實驗的特異性、信噪比和數據準確性。
多色流式細胞術該如何進行配色？
流式細胞實驗表面上是一個非常簡單的試驗，但是對于大多數新手來說，除了要慎重選擇抗體之外，還要熟悉如何進行熒光配色，最大限度地減少對補償和重疊的調整，這也是流式實驗的重中之重。
大部分科研工作者對流式的應用還局限于四色以內分析，對于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合適，導致各染料之間干擾很大，結果很難分析。本文總結了流式多色染色熒光搭配的幾點技巧以供參考：
技巧1：選擇合適的目標 Marker并確定Marker 的表達位置
通過查閱相關文獻，在試驗之前需要確定好Marker以及Marker 之間的邏輯關系（圈門的父子關系，比如 T 細胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。
對于細胞質或者細胞核的 Marker，需要對細胞進行固定破膜/破核膜。在做胞質或胞核 Marker 染色實驗操作時，需要先染細胞表面 Marker，再對細胞進行固定破膜，最后對胞內或核內 Marker 染色。
一般來說，絕大部分 CD 分子指標，都是細胞表面指標；IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，屬于胞內指標；而最常見的核內染色指標是 Foxp3（如表）
技巧2：選擇流式細胞儀能檢測的染料
要充分了解流式細胞儀有哪些激光器，有哪些濾光片通道，充分利用儀器允許的全部熒光染料，盡量選用多激光激發(fā)。
如圖2列出了流式細胞儀的激發(fā)器和每個激發(fā)器對應能檢測的染料[1]。下圖只是列出了每個激發(fā)器可能激發(fā)的染料，并未列出所有染料，并不是儀器配置了該激發(fā)器就一定能激發(fā)出對應的染料，還需要根據儀器的通道配置來選擇，即每個激發(fā)器對應有哪些檢測通道，而每個檢測通道只能對應檢測一種染料，但不同染料可能是由同一個檢測通道來檢測，那么這些染料我們稱之為熒光對等染料，熒光對等染料是不能共用的。
▲圖2：不同激發(fā)器可激發(fā)的熒光染料
技巧3.強弱互補
熒光染料亮度有強弱之分，抗原表達有高低區(qū)別，因此弱表達抗原應該選擇強熒光染料，強表達抗原選擇弱熒光染料，使染料的亮度與抗原密度匹配。通常，根據待測細胞類型中，相應抗原的表達量，可以粗略地將抗原分子分為三類[2]：
1）很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽性細胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。
2）很容易鑒定、較高水平表達、經常連續(xù)性表達。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
3）低水平表達、激活性 Marker、未知但關鍵。例如：CD25，STAT5，F(xiàn)oxp3 等。
同樣，弱表達抗原放在被干擾較小的檢測通道，而強表達抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測時，弱表達抗原應該搭配APC熒光染料標記的抗體；強表達的抗原最終染色的信號較強，容易對其他檢測通道造成干擾，因此我們應該選擇對其他通道干擾較小的熒光染料。
因抗原表達密度受細胞類型以及細胞活化程度的影響，所以在此無法詳細列出各抗原的表達密度強弱。但熒光染料的強弱是固定的，熒光的強度與染色指數(Stain Index)有關，一般染色指數越高，熒光強度越好；染色指數較低，染色強度相對較差，通過染色指數可以直接比較出各個熒光染料的強度（如圖3）。
▲圖3：不同類型熒光染料的染色指數排行[3]
技巧4：表達互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道，共表達的抗原避免放在相互干擾的通道
表達相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會同時表達在一種細胞上，這兩種抗原表達在兩種細胞上（例如CD4和CD8），因此流式圖上分群很明顯，即使熒光染料之間干擾很大，也很容易通過補償的調節(jié)避免干擾；
而共表達的抗原指的是這兩種抗原表達在同一種細胞上（例如CD4和CD25），在流式圖上我們是要分析雙陽性的細胞比例，因此如果這兩個抗體對應的熒光染料之間有干擾，則會對圈門結果造成干擾，影響分析的細胞比例。
當然，選擇優(yōu)質的特異性抗體是實驗成功的根本保證。在設計多色流式 panel 時，重要的是要了解儀器的配置，以及如何最佳地組合多種熒光染料，以最大程度地減少光譜重疊、提高結果的準確性。
TargetMol 可為您提供多種靶點的流式抗體，可用于流式細胞熒光分選技術（FACS）、 ELISA、免疫印跡試驗（Western Blot, WB）和免疫熒光(Immunofluorescence, IF)等多種實驗。
TargetMol流式抗體產品
目前，TargetMol 可提供超過 2350+ 種流式抗體產品，覆蓋了多種不同靶點、不同宿主，不同熒光標記的特異性檢測一抗。我們的產品以溶液形式提供，操作簡單方便。產品本身有嚴格的質控、高批次間一致性、高純度和高親和力；能夠滿足多種不同檢測靶點對于流式抗體的特異性和靈敏度要求。
TargetMol流式抗體產品優(yōu)勢
哺乳動物表達系統(tǒng)：
我們的抗原使用哺乳動物表達系統(tǒng)，能最大限度保留人源蛋白天然結構、功能以及翻譯后修飾。
兔源單克隆重組抗體：
我們的抗體使用兔子為免疫載體，兔子具有成熟的免疫機制并且與人同源性低。兔源抗體具有親和力強、靈敏度高、特異性強、多樣性豐富等特點。此外，重組抗體的制備批次間差異小。
高穩(wěn)定性：
產品均通過凍融穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性測試，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
高覆蓋度、多表位、多標記：
針對370+種人源蛋白兔單抗，每種抗原可提供多個潛在不同表位的抗體，系列抗體可以間接標記多種熒光蛋白（APC、PE等）或熒光小分子（AF488、AF555、AF647等）。
產品驗證數據：
參考資料：
[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973.
[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.
