作者：彪彪 文章來源抗體圈 2024年11月07日 15:25 湖北

摘要：雙特異性抗體（bsAbs）能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)基于IgG的抗體無法達到的新型作用機制和/或治療應(yīng)用。因此，這些分子在過去十年中引起了極大的興趣，并且截至2023年底，已有14種bsAbs獲得批準：11種用于治療癌癥，3種用于非腫瘤學指征。bsAbs有不同格式，針對不同的目標，并通過不同的分子機制介導抗癌功能。在這里，我們提供了bsAbs在癌癥治療領(lǐng)域最新進展的概述。我們專注于已批準或處于臨床開發(fā)中的bsAbs，包括bsAb介導的信號通路雙重調(diào)節(jié)劑、腫瘤靶向受體激動劑、bsAb-藥物偶聯(lián)物、雙特異性T細胞、自然殺傷細胞和先天免疫細胞的招募者，以及雙特異性檢查點抑制劑和共刺激因子。最后，我們對處于更早開發(fā)階段的下一代bsAbs進行了展望，包括三特異性抗體、bsAb前藥、誘導腫瘤目標降解的bsAbs以及作為細胞因子模擬物的bsAbs。

引言 
bsAbs用于雙重受體抑制 bsAbs用于配體-受體抑制 bsAbs用于受體激活 bsAbs用于靶向載荷遞送 bsAbs用于癌癥免疫治療、 新興概念 、展望，雙特異性抗體通過新生兒Fc受體（FcRn）循環(huán)利用。Fc部分的突變可以改變與FcRn的結(jié)合，從而改變抗體的半衰期。在不包含F(xiàn)c部分的bsAbs中，可以通過其他方式實現(xiàn)類似IgG的藥代動力學，例如結(jié)合到人血清白蛋白（HSA）或其他可以延長半衰期的分子。

目前有超過幾百種不同類型的bsAb格式，其中多種格式在已批準和處于臨床開發(fā)中的分子中使用。目前，大多數(shù)已批準的bsAbs和處于藥物開發(fā)高級階段的分子主要用于癌癥免疫治療。其他針對新型藥物遞送的實體也在開發(fā)中，例如基于bsAb的抗體-藥物偶聯(lián)物（bsADCs）或雙重靶向與癌癥相關(guān)的信號通路（圖1）。我們最近在http://ClinicalTrials.gov、Cortellis和The Antibody Society的數(shù)據(jù)搜索顯示，有超過200種不同的雙特異性分子的300多項臨床試驗正在進行中，其中約75%用于治療實體瘤，25%用于治療血液惡性腫瘤（圖1）。

目前有十種bsAb藥物已獲批準用于癌癥治療，其中九種在美國和/或歐洲獲批準，卡多尼利單抗在中國獲批準。在這十種bsAbs中，有九種可以歸類為TCEs�？ㄋ�莫單抗是首個獲批準的bsAb，于2013年退出市場（表1和圖2）。

值得注意的是，今天在臨床開發(fā)中的相當一部分bsAbs已經(jīng)處于后期階段（第二階段和第三階段）。我們發(fā)現(xiàn)，用于治療實體瘤的bsAbs主要由免疫調(diào)節(jié)劑主導，包括雙重CPIs（約45%）和TCEs（約33%），其次是針對雙重通路的bsAbs、ICEs和雙重ADCs。相比之下，TCEs是用于治療血液惡性腫瘤的主要bsAbs類別（約75%），其次是ICEs、雙重CPIs和NKCEs（圖3）。我們數(shù)據(jù)集中的bsAbs針對60多個不同的目標，使用超過50種不同的bsAb格式，涉及100多種目標組合。

然而，我們承認，該領(lǐng)域的增長速度很快，新的bsAbs，可能具有新的目標和格式，已經(jīng)進入臨床試驗，自我們分析以來。盡管如此，本綜述旨在提供一份基于MoA的全面概述，介紹作為癌癥治療開發(fā)的bsAbs的最新進展，重點關(guān)注截至2023年底在同行評審出版物中描述的bsAbs。雙受體抑制的bsAbs 許多參與細胞信號傳導的細胞表面蛋白，如RTKs及其相關(guān)受體，是抗體基療法的驗證目標。幾十年前，對這些蛋白的研究，包括歷史上的先行者表皮生長因子受體（EGFR；也稱為HER1）、HER2、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和針對它們的抗體，為幾乎所有后續(xù)的抗體基治療發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。盡管結(jié)合一個定義的信號實體的抗體基療法相當有效，但與疾病相關(guān)的表現(xiàn)型通常由多個通路觸發(fā)。這種冗余允許細胞通過使用其他補償性信號通路來克服單一目標或通路的藥理學生長抑制或誘導細胞毒性。同時調(diào)節(jié)不同的與疾病相關(guān)的信號受體和/或通路的bsAbs可以減少或克服這種限制。Amivantamab（JNJ-61186372）靶向EGFR和肝細胞生長因子受體（MET）。兩種受體都會觸發(fā)非小細胞肺癌（NSCLC）的增殖，因此，阻斷兩者可以比僅阻斷一個通路更有效地抑制NSCLC的生長。Amivantamab已獲批準用于治療攜帶EGFR外顯子20插入突變的NSCLC亞型。

圖1 | 用于癌癥治療的雙特異性抗體在臨床開發(fā)中。

目前有200多種雙特異性抗體（bsAbs）正在進行臨床開發(fā)，根據(jù)癌癥類型、臨床階段和作用模式進行分組。正在進行臨床開發(fā)的bsAbs中有50%處于II期和III期或已經(jīng)獲批。大約四分之三的bsAbs被開發(fā)用于治療實體瘤，實體瘤治療主要由T細胞招募劑（TCEs；32.9%）和具有檢查點抑制和/或免疫調(diào)節(jié)作用機制（MoAs）的bsAbs（45.1%）所主導。相比之下，血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療主要由TCEs（75%）和其他MoAs（21.9%）所主導，這些MoAs涉及免疫學活動，如通過檢查點抑制和/或免疫調(diào)節(jié)激活自然殺傷細胞和其他免疫細胞，這歸功于高度腫瘤選擇性或譜系特異性抗原的可用性。值得注意的是，約有10%用于實體瘤治療的bsAbs采用雙重信號抑制。迄今為止，正在開發(fā)的bsAb抗體-藥物偶聯(lián)物（ADCs）用于治療實體瘤。CPI，檢查點抑制劑；ICE，先天細胞招募劑；NKCE，自然殺傷細胞招募劑。

雙特異性抗體用于配體-受體抑制 
受體激活可以通過干擾受體二聚體化或復(fù)合物形成，或通過阻斷受體的配體結(jié)合位點來抑制。在癌癥中，通常來自幾個互補或補償通路的配體和受體有助于腫瘤進展和治療抗性。bsAbs可以同時阻斷兩種不同的配體，無論是可溶的還是細胞膜結(jié)合的，或者是配體和受體的組合。這種方法不僅用bsAbs來解決，也用雙特異性或雙位點基于支架的結(jié)合劑來解決，這里我們不包括。雙重靶向VEGF和血管素2（ANG2）以阻斷分別參與血管生成的VEGFR和血管素-1受體（TIE2）的激活，已成為包括微轉(zhuǎn)移的血管生成轉(zhuǎn)換在內(nèi)的實體瘤中幾項臨床試驗的主題。BI836880是一種三特異性納米抗體（Nb）融合蛋白，由三個靶向VEGFA、ANG2和HSA的納米抗體組成，后者用于延長其血清半衰期。這種化合物目前正在對頭頸鱗狀細胞癌、NSCLC和其他實體瘤患者進行I期研究。值得注意的是，vanucizumab，一種靶向VEGFA和ANG2的bsAb，在與化療聯(lián)合使用的臨床前模型中顯示出抗腫瘤、抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)，但在與化療聯(lián)合使用時，并未在結(jié)直腸癌患者中提高無進展生存期，超過VEGF抑制。將VEGF抑制與另一種拮抗活性相結(jié)合的概念進一步應(yīng)用于靶向VEGF和Delta樣規(guī)范Notch配體4（DLL4）的bsAbs。DLL4是一種細胞表面配體，激活Notch-1受體通路，該通路在腫瘤血管生成中起著核心作用。幾種靶向VEGF和DLL4的雙特異性抗體已經(jīng)進入臨床試驗，包括navicixizumab、dilpacimab和CTX009/ABL001。Navicixizumab是一種四價雙特異性抗體，具有四個結(jié)合位點，其中兩個基于單鏈可變片段（scFv）融合，它在與紫杉醇聯(lián)合使用時在鉑類耐藥卵巢癌患者中展示了有希望的臨床活性，并具有可管理的毒性，表明這種方法可能在某些適應(yīng)癥中提供臨床益處。相比之下，另一項針對四價雙特異性抗體dilpacimab的II期研究，與亞葉酸、氟尿嘧啶和伊立替康（FOLFIRI）聯(lián)合使用，揭示了安全問題。

表1 | 批準用于癌癥治療的雙特異性抗體

ADCC，抗體依賴性細胞毒性；ALL，急性淋巴細胞性白血病；BCMA，B細胞成熟抗原；BiTE，雙特異性T細胞招募劑；bsAb，雙特異性抗體；DLBCL，彌漫性大B細胞淋巴瘤；EGFR，表皮生長因子受體；EpCAM，上皮細胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶聯(lián)受體C類5成員D；MoA，作用機制；NSCLC，非小細胞肺癌；NHL，非霍奇金淋巴瘤；scFv，單鏈可變片段；TCR，T細胞受體；TDCC，T細胞依賴性細胞毒性。批準區(qū)域限于美國、歐洲聯(lián)盟（EU）、日本和中國；產(chǎn)品也可能在其他國家獲得批準。狀態(tài)截至2023年底。

靶向VEGF和PDL1或PD1的雙特異性抗體 
基于VEGF抗體和免疫檢查點抑制劑（CPI）聯(lián)合治療的積極結(jié)果，上述概念進一步適應(yīng)于設(shè)計靶向VEGF和腫瘤細胞上的PDL1或T細胞上的PD1的雙特異性抗體，從而將抗血管生成與免疫腫瘤學方法相結(jié)合。使用這種方法最先進的分子是ivonescimab（AK112），它針對PD1和VEGF。目前，ivonescimab的上市申請正在中國接受監(jiān)管審查。其他雙特異性抗體靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，目前正在進行II/III期研究（NCT05756972），針對NSCLC患者。受體激活的雙特異性抗體 許多抗腫瘤反應(yīng)是通過激活細胞表面受體介導的，包括免疫反應(yīng)或通過誘導凋亡的細胞死亡。癌癥治療的一種方法是通過將受體激活配體（如生長因子、細胞因子和（共）免疫刺激配體）融合到抗體或抗體片段上，實現(xiàn)受體激活配體的靶向遞送，以誘導局部或組織特異性的激動活性，從而引發(fā)細胞反應(yīng)。越來越多的這些抗體-配體融合蛋白正在進入臨床試驗。受體激活也可以通過激動性抗體來實現(xiàn)。腫瘤壞死因子（TNF）超家族的成員，包括死亡配體（如TNF配體超家族成員10（TNFSF10）；也稱為TRAIL）及其各自的死亡受體（如TRAIL受體1和2；也稱為DR4和DR5），或具有免疫細胞共刺激活性的配體（如TNFSF9；也稱為4-1BBL）及其受體（如TNFRSF9；也稱為4-1BB或CD137）在癌癥治療中引起了特別關(guān)注。然而，單克隆抗體在臨床試驗中取得了相當令人失望的結(jié)果。原因是許多TNFRSFs需要超過兩個受體的交聯(lián)以激活，這只能通過Fc-FcγR介導的抗體在細胞表面的超聚集來實現(xiàn)，因此依賴于TME中表達足夠數(shù)量FcγR的先天免疫細胞。作為替代方案，針對目標抗原和TNFRSF成員的雙特異性抗體已被證明可以作為強大且腫瘤選擇性的激動分子，模仿表面展示配體的活性。這尤其適用于DR4和DR5，DR5需要多個受體的聚集才能激活。值得注意的是，針對DR5和表面抗原的雙特異性抗體，如成纖維細胞激活蛋白-α（FAPα；也稱為脯氨酸內(nèi)肽酶FAP）、鈣粘蛋白17（CDH17）或葉酸受體-α（FRα），不僅有效地誘導受體激活，還避免了通過誘餌受體的隔離50。RG7386（RO6874813），一種針對癌癥相關(guān)成纖維細胞上的FAPα和DR5的四價雙特異性抗體，在體外和體內(nèi)在表達FAPα的基質(zhì)的小鼠中觸發(fā)了強效且選擇性的腫瘤細胞殺傷，并已進入臨床測試，但由于戰(zhàn)略投資組合優(yōu)先級而隨后中止。此外，BI905711，一種針對DR5和CDH17的四價雙特異性IgG-scFv融合蛋白，目前正在進行I期臨床研究，顯示出在CDH17陽性目標細胞上的效力比單克隆抗體提高了1000倍以上，轉(zhuǎn)化為在結(jié)直腸癌模型中的強效且選擇性的抗腫瘤活性。相同的格式用于針對DR5和FOLR1的雙特異性抗體，F(xiàn)OLR1是一種富集于卵巢癌的受體，已被證明介導順式（在同一細胞上）和反式（在兩個不同細胞上）的細胞毒性，其中FOLR1作為有效DR5激活的聚集點。從概念上講，這種MoA也可以轉(zhuǎn)移到依賴于受體聚集的TNFRSF家族的共刺激成員，包括4-1BB、OX40和CD40（見圖3），使用針對腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）的雙特異性抗體，但也針對其他目標，如PDL1，從而將共刺激與檢查點抑制相結(jié)合（見下文）。

用于靶向載荷遞送的雙特異性抗體 
存在兩種概念上不同的方法，用于使用雙特異性抗體進行有效載荷（如細胞毒素或放射性）的靶向遞送。第一種方法，預(yù)靶向治療，使用雙特異性抗體的一個結(jié)合特異性來靶向腫瘤細胞，另一個結(jié)合特異性隨后捕獲腫瘤上的載荷。這類雙特異性抗體結(jié)合到腫瘤上的癌癥靶標，如癌胚抗原（CEACAM5）或HER2，然后捕獲由雙特異性抗體的第二個結(jié)合特異性識別的放射性標記載荷/復(fù)合物。

圖2 | 已批準用于癌癥治療的雙特異性抗體概覽。

a, 雙特異性T細胞招募劑（TCEs）。
b, 其他雙特異性抗體（bsAbs）（非T細胞招募劑（非TCEs））。
11種已批準的bsAbs中有6種具有IgG樣結(jié)構(gòu)，由2條重鏈（恒定區(qū)域以深灰色顯示，Vh結(jié)構(gòu)域以深藍色或深紅色顯示）和2條輕鏈（恒定結(jié)構(gòu)域以淺灰色顯示，Vl結(jié)構(gòu)域以淺藍色或淺紅色顯示）組成。它們大多數(shù)具有1+1的化學計量比 —— 每個抗原一個結(jié)合位點 —— 還有一個TCE通過將一個額外的Fab片段融合到一條重鏈上，利用2+1的化學計量比。其他的bsAbs要么是不含F(xiàn)c的融合蛋白，由兩個單鏈可變片段（scFv）片段組成（blinatumomab），要么是將scFv片段與T細胞受體（TCR）片段融合，或者是具有2+2化學計量比的IgG-scFv融合蛋白。除了由小鼠和大鼠雜交瘤細胞技術(shù)生產(chǎn)的catumaxomab外，所有其他的bsAbs都是通過重組技術(shù)生產(chǎn)的。對于IgG樣異二聚體分子，通過在CH3域使用突變來強制異二聚體化 —— 如旋鈕-入洞技術(shù) —— 或控制的Fab臂交換（cFAE），解決了兩種不同重鏈的正確組裝問題，cFAE還允許從兩種不同的單特異性IgG組裝IgG樣分子。cFAE還解決了輕鏈問題，即輕鏈和重鏈的配對�；蛘撸�如CrossMab方法所示，對Fab臂進行進一步的修改，以強制正確的輕鏈和重鏈配對。值得注意的是，所有重組IgG樣bsAbs都包含一個具有沉默或減少效應(yīng)功能的Fc區(qū)域，這是通過在鉸鏈/CH2域引入突變來避免或減少Fcγ受體和補體結(jié)合來實現(xiàn)的。BCMA，B細胞成熟抗原；EGFR，表皮生長因子受體；EpCAM，上皮細胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶聯(lián)受體C類5成員D。最近，被稱為SADA的雙特異性抗體利用改良的p53四聚體化域來延長GD2×DOTA在腫瘤中的滯留時間。

GD2×DOTA是一種雙特異性抗體，能夠識別在癌癥中高表達的二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，以及放射性載荷177Lu-DOTA，在腫瘤微環(huán)境中組裝并滯留在那里，但沒有四聚體化，它會迅速從周圍清除，因為它缺乏半衰期延長。到目前為止，很少有臨床試驗中的雙特異性抗體使用這種MoA，可能是由于與預(yù)靶向放射性相關(guān)的復(fù)雜物流限制了其普遍適用性。

圖3 | 目前正在臨床試驗中的雙特異性抗體的作用機制。

a, 通過受體阻斷兩種不同的信號受體（以不同顏色表示）來抑制信號傳導。
b, 通過抑制可溶性配體（藍色）和受體來抑制信號。
c, 通過雙重阻斷兩種不同的配體來抑制信號。
d, 通過雙特異性抗體（bsAb）藥物偶聯(lián)物（偶聯(lián)物以淺藍色表示）進行藥物傳遞。
e, 針對性阻斷“別吃我信號”（CD47–SIRPα相互作用），導致巨噬細胞的吞噬作用。
f, 結(jié)合檢查點抑制，阻斷“別吃我信號”。
g, 通過T細胞受體（TCR）上的CD3或自然殺傷細胞上的CD16（FcγRIIIa）激活效應(yīng)細胞。
h, 腫瘤細胞結(jié)合介導的免疫細胞（共）刺激。
i, PDL1結(jié)合介導的免疫細胞（共）刺激。
j, 雙重免疫細胞共刺激。
k, 腫瘤靶向PDL1途徑抑制。
l, 腫瘤靶向PD1途徑抑制。
m, 檢查點結(jié)合介導的免疫細胞（共）刺激。
n, 雙重檢查點抑制。
o, 通過配體阻斷實現(xiàn)雙重檢查點和可溶性轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGFβ）信號的抑制。展示了用于實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的目標分子和腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）的例子。
注意：bsAbs可以同時發(fā)揮多種作用機制（MoAs）。Ang2，血管生成素2；APC，抗原呈遞細胞；BCMA，B細胞成熟抗原；CDH17，鈣粘蛋白17；DLL4，典型Notch配體4；EGFR，表皮生長因子受體；EpCAM，上皮細胞粘附分子；FRα，葉酸受體α；GPRC5D，G蛋白偶聯(lián)受體C類5成員D；HLA，人類白細胞抗原；ICOS，誘導性T細胞共刺激因子；LAG3，淋巴細胞相關(guān)基因3；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細胞免疫受體；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子。雙特異性抗體藥物偶聯(lián)物 第二種方法通過同時靶向腫瘤細胞表面的兩個表位或兩個目標，實現(xiàn)了通過雙特異性抗體藥物偶聯(lián)物（bsADCs）傳遞細胞毒素載荷的特異性靶向。處于臨床開發(fā)中的bsADCs的例子包括zanidatamab zovodotin（ZW49），這是一種雙特異性HER2結(jié)合抗體zanidatamab與auristatin衍生的細胞毒素載荷偶聯(lián)，雙特異性MET×MET bsADC REGN5093或izalontaxab brengitecan（BL-B01D1），一種EGFR×HER3 bsAb與一種新型TOPO-I抑制劑偶聯(lián)（NCT05194982）（表2）。

雙特異性抗體用于癌癥免疫治療 
大多數(shù)用于癌癥免疫治療的雙特異性抗體通過T細胞驅(qū)動的自然或內(nèi)源性免疫發(fā)揮作用，例如通過增強現(xiàn)有的抗腫瘤反應(yīng)和/或克服檢查點抑制，或通過提供合成免疫，例如通過bsAb驅(qū)動的免疫細胞的參與、激活和招募（圖3）。在這一部分中，我們提供了包括CPIs、效應(yīng)細胞招募劑（包括TCEs和ICEs）和共刺激雙特異性抗體在內(nèi)的最突出的MoAs的概述。雙重CPIs 許多干擾免疫檢查點（如CTLA4或PD1/PDL1）的單特異性抗體已獲批準用于癌癥免疫治療，包括ipilimumab、tremelimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab或cemiplimab。將免疫檢查點抑制抗體治療擴展到包括雙特異性抗體可能會減少不良副作用并提高觀察到的單特異性抗體治療的療效。第一個方面，檢查點抑制的安全性，包括預(yù)防自身免疫相關(guān)事件和/或不希望的免疫細胞激活。為了實現(xiàn)這一目標，正在開發(fā)針對檢查點抑制功能和TAAs（如RTKs）的雙特異性抗體，目的是將其活動更優(yōu)先地集中在腫瘤上，正在開發(fā)中。第二個方面，檢查點免疫治療的療效，通過雙特異性抗體同時靶向兩種不同的檢查點蛋白來提高療效并降低抗性的可能性，或提供互補的免疫刺激信號。值得注意的是，這些雙特異性抗體的共同設(shè)計原則是提高對表達兩種檢查點蛋白的T細胞的選擇性，如CTLA4/PD1或PD1/淋巴細胞相關(guān)基因3（LAG3），這些蛋白可能更具腫瘤反應(yīng)性，目標是提供比單獨檢查點阻斷更優(yōu)越的治療指數(shù)。

表2 | 晚期臨床開發(fā)中選擇的雙特異性抗體概覽

BiTE，雙特異性T細胞招募劑；BCMA，B細胞成熟抗原；bsAb，雙特異性抗體；BTC，膽管癌；cL，普通輕鏈；DART，雙親和重定向；DLL4，類似Delta的典型Notch配體4；EGFR，表皮生長因子受體；EpCAM，上皮細胞粘附分子；Fchet，異二聚體化Fc；LAG3，淋巴細胞相關(guān)基因3；Nb，納米抗體；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NSCLC，非小細胞肺癌；PDC，胰腺導管腺癌；scFv，單鏈可變片段；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細胞免疫受體；TGFβ，轉(zhuǎn)化生長因子β；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子。a晚期包括關(guān)鍵性II期、II/III期和III期臨床研究。例如，通過降低自身免疫不良事件的發(fā)生率 —— 而不是與聯(lián)合檢查點阻斷相比。探索腫瘤靶向檢查點抑制的工作包括開發(fā)雙特異性抗體，這些抗體靶向腫瘤細胞表面的HER家族RTKs，并結(jié)合PD1/PDL1信號通路的阻斷作為第二功能，從而將PDL1結(jié)合劑定向到腫瘤細胞。這些分子的特定腫瘤靶向?qū)е铝藢Ρ磉_EGFR的腫瘤細胞更具特異性和增強的活性。類似地，一種特別結(jié)合HER2和PDL1的雙特異性抗體被證明可以在HER2表達的腫瘤細胞中特異性阻斷PDL1活性，從而比單獨使用每個實體或在不作為雙特異性抗體結(jié)合時聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生更大的治療效果。另一種雙特異性抗體介導的靶向免疫治療方法包括將PDL1阻斷與識別黑色素瘤上的軟骨素硫酸蛋白聚糖4（CSPG4）的結(jié)合物相結(jié)合。特定的腫瘤靶向增強了抗腫瘤T細胞的特異性、激活狀態(tài)和療效。概念上相關(guān)的方法包括將PDL1結(jié)合物與黑色素細胞刺激激素化學偶聯(lián)。通過這種方式，PDL1抑制活性被定向到黑色素瘤細胞上的黑色素皮質(zhì)素-1受體。同時靶向兩個檢查點蛋白而不額外包括常見的腫瘤細胞表面靶標的雙特異性抗體的例子包括同時結(jié)合腫瘤細胞上的PD1和PDL1的雙特異性抗體。Wan等人分析了這種雙特異性抗體在高級別漿液性卵巢癌類器官與免疫細胞共培養(yǎng)中引發(fā)的聯(lián)合活性。與單特異性結(jié)合物相比，雙特異性抗體介導了優(yōu)越的療效，并在T細胞和自然殺傷細胞中誘導了表型變化，包括激活狀態(tài)和細胞毒性的改變。雙特異性抗體LY3434172也采用了這種方法。通過完全抑制PD1/PDL1途徑，LY3434172顯示出比每個親本抗體或兩者組合更大的抗腫瘤活性，再次證明以雙特異性抗體形式的結(jié)合很重要，并且可以增加療效。超越PD1/PDL1方法的界限，包括CTLA4在內(nèi)的其他免疫受體的雙特異性抗體正在開發(fā)或已獲批準。同時靶向PD1和CTLA4是雙特異性抗體cadonilimab的作用機制。Cadonilimab由于四價性，介導了對高密度PD1和CTLA4的增加親和力驅(qū)動的目標結(jié)合，這與Fc突變以廢除FcγR結(jié)合相結(jié)合，可能是其有利的治療指數(shù)的基礎(chǔ)。值得注意的是，cadonilimab還在PD1+和CTLA4+ T細胞之間介導了跨結(jié)合。在晚期實體瘤患者的I/Ib期研究中，cadonilimab顯示出抗腫瘤活性和有利的安全性概況，免疫相關(guān)不良事件的發(fā)生率低。Cadonilimab已在中國獲批準用于治療在鉑類化療后或化療期間進展的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性宮頸癌。其他在高級臨床試驗中結(jié)合相同特異性的雙特異性抗體是MGD019和MEDI5752。MGD019結(jié)合了PD1和CTLA4結(jié)合物，在進行中的臨床研究中觀察到可接受的安全性和組合阻斷以及在多種實體瘤中的客觀反應(yīng)。MEDI5752目前正在進行臨床評估，它結(jié)合了PD1和CTLA4，并顯示了PD1介導的靶向，因為它優(yōu)先飽和了PD1+ T細胞上的CTLA4，并引起了PD1的快速內(nèi)化和降解。與cadonilimab相比，MGD019和MEDI5752似乎對雙陽性T細胞顯示出更強的親和力驅(qū)動的選擇性增益。雙重失活也在探索中，通過結(jié)合PD1/PDL1阻斷與LAG3或TIM3抑制。例子是IBI323和FS118，它們都結(jié)合了PDL1和LAG3，并在臨床前模型中顯示出增強的雙重功效。

LY3415244結(jié)合了PDL1和TIM3的阻斷，作為一種不同的免疫調(diào)節(jié)劑，但由于在I期研究中觀察到的免疫原性，該分子的開發(fā)被終止。最近，I期劑量遞增和擴展數(shù)據(jù)的臨床試驗顯示，PD1×LAG3雙特異性抗體tebotelimab在實體瘤或血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中作為單藥治療以及與HER2抗體margetuximab聯(lián)合治療時顯示出有希望的活性。雙配體抑制是另一種基于雙特異性抗體的檢查點抑制方法。PDL1和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGFβ）是具有互補且非冗余免疫抑制活性的受體結(jié)合配體。TGFβ不僅具有免疫抑制作用，還可以進一步誘導促血管生成因子的上調(diào)和癌癥相關(guān)成纖維細胞的激活。目前正在開發(fā)幾種靶向PDL1和TGFβ的雙特異性抗體，如類似雙特異性抗體融合蛋白的bintrafusp alfa（M7824）。在這種情況下，PDL1的結(jié)合是通過一個“標準”的抗體結(jié)合模塊實現(xiàn)的，而TGFβ則被人類TGFβ受體II的細胞外域捕獲。Bintrafusp alfa在臨床前研究中顯示了激活先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，從而比單獨使用抗PDL1抗體或TGFβ陷阱模塊更好地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，目前正在進行臨床試驗。Retlirafusp alfa（SHR-1701），另一種以類似方式靶向PDL1和TGFβ的雙功能融合分子，正在對宮頸癌和胃癌或胃食管結(jié)合部癌癥患者進行III期研究（表2）。YM101是一種TGFβ×PDL1雙特異性抗體，目前處于臨床前開發(fā)階段。YM101的一個替代品，Y101D，正在對晚期實體瘤患者進行評估（NCT05028556）。所有同時對抗抑制性TGFβ和PD1/PDL1途徑的方法在體內(nèi)模型中顯示出比單獨使用各自結(jié)合物更高的抗腫瘤活性，但迄今為止尚未在臨床上證明概念。針對性的TGFβ信號阻斷也已經(jīng)在臨床前研究中通過阻斷CD4+ T細胞中的TGFβ信號的雙特異性抗體實現(xiàn)。為此，將非免疫抑制性的CD4靶向抗體ibalizumab與TGFβ陷阱以類似于上述的雙特異性抗體方式結(jié)合。這導致在輔助T細胞中針對性阻斷TGFβ信號，可以釋放抗腫瘤反應(yīng)。通過雙特異性抗體招募磷酸酶抑制PD1是一種最近報道的新型MoA88。這是通過一個單域（Vhh）融合到一個scFv實現(xiàn)的，將PD1連接到細胞表面磷酸酶CD45，這反過來觸發(fā)細胞內(nèi)去磷酸化。這種方法與單獨使用PD1抗體介導的配體阻斷相比，增強了檢查點阻斷的抑制。按照同一原則，雙特異性抗體可以將細胞表面磷酸酶CD45與抑制性自然殺傷細胞表面受體NKG2A或Ly49連接，以進行后續(xù)去磷酸化。這樣的雙特異性抗體可以阻斷并同時去磷酸化它們的目標，可能比相應(yīng)的單特異性抗體及其抑制信號的組合更有效的拮抗劑，以增強自然殺傷細胞和T細胞的抗腫瘤活性。使用雙特異性抗體對CD73的不同表位進行雙位點靶向是另一種雙特異性抗體相關(guān)方法，以抵消免疫抑制活性或增強針對腫瘤的免疫能力。CD73產(chǎn)生免疫抑制性腺苷，其通過內(nèi)化的雙特異性抗體介導的抑制和耗盡比單一位點CD73抗體更有效。效應(yīng)細胞招募劑 T細胞招募劑在過去二十年中，專門結(jié)合腫瘤表面抗原和TCR的CD3ε鏈的T細胞招募劑（TCEs）在這一類雙特異性抗體中占據(jù)主導地位，描述了數(shù)百種TCEs，并且有100多種進入臨床開發(fā)。

事實上，第一個獲準上市的雙特異性抗體是鼠/大鼠嵌合的上皮細胞粘附分子（EpCAM）×CD3ε雙特異性抗體catumaxomab，它在2009年被歐洲聯(lián)盟（EU）批準用于惡性卵巢腹水的腹腔內(nèi)治療，但后來因商業(yè)原因退出市場。目前正在中國再次進行臨床試驗，用于腹腔內(nèi)給藥。系統(tǒng)應(yīng)用的catumaxomab顯示出嚴重的輸注反應(yīng)和高免疫原性發(fā)生率，可能由于其鼠/大鼠嵌合的恒定區(qū)域和保留的FcγR結(jié)合，導致在沒有抗原結(jié)合的情況下非特異性FcγR和TCR激活。

隨后，下一代TCEs被設(shè)計為缺乏Fc部分，如基于串聯(lián)scFv的CD19×CD3ε雙特異性T細胞招募劑（BiTE）blinatumomab，它在2014年首次被批準用于治療B細胞前體急性淋巴細胞性白血�。˙-ALL）。然而，由于缺乏通過FcRn的循環(huán)，這種療法需要持續(xù)輸注，F(xiàn)cRn通過從分揀內(nèi)體循環(huán)到細胞表面，從內(nèi)溶酶體降解中挽救IgG�；�于blinatumomab的成功，針對血液和實體瘤的各種目標的BiTEs被開發(fā)出來，但最終沒有進入晚期臨床試驗，由于BiTEs和相關(guān)短半衰期的藥代動力學特性不佳。

人們嘗試通過納入FcγR結(jié)合惰性Fc結(jié)構(gòu)域（沉默F(xiàn)c）或HSA結(jié)合部分來實現(xiàn)bsAbs的IgG樣半衰期，目前大多數(shù)處于開發(fā)中的TCEs是基于IgG和/或具有IgG樣藥代動力學的。值得注意的是，大多數(shù)TCEs使用單個單價結(jié)合位點用于CD3作為T細胞上的觸發(fā)分子，以避免在沒有同時目標結(jié)合的情況下TCR交聯(lián)引起的系統(tǒng)性T細胞激活。然后它們使用一個（1+1）或兩個（2+1）腫瘤目標的結(jié)合位點，因為雙價結(jié)合可以在腫瘤選擇性和效力方面提供優(yōu)勢。CD20×CD3ε雙特異性抗體mosunetuzumab106和B細胞成熟抗原（BCMA）×CD3ε雙特異性抗體teclistamab是第一批異二聚體1+1 IgG基TCEs，分別在2022年被批準用于治療復(fù)發(fā)/難治性濾泡性非霍奇金淋巴瘤（NHL）或多發(fā)性骨髓瘤。在2023年，異二聚體2+1 CD20-TCE glofitamab104,108和1+1 CD20-TCE epcoritamab109被批準用于治療復(fù)發(fā)/難治性彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL），以及1+1 G蛋白偶聯(lián)受體C類5成員D（GPRC5D）-TCE talquetamab110和BCMA-TCE elranatamab111用于復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤（表1）。CD20-TCE odronextamab112和BCMA-TCE linvoseltamab的上市申請正在等待監(jiān)管決定。鑒于它們在復(fù)發(fā)/難治性B細胞和漿細胞惡性腫瘤患者中顯示出的有希望的臨床療效和完全緩解率 —— 包括在CAR-T細胞治療后復(fù)發(fā)的患者中的活性 —— 以及它們作為現(xiàn)成療法的簡單可用性以及皮下給藥的可能性，可以預(yù)期TCEs將成為CAR-T細胞療法的主要替代品，特別是隨著它們開始被開發(fā)用于更早期的治療線并且可以讓患者輕松獲得。免疫動員單克隆T細胞受體針對癌癥（ImmTACs）是結(jié)合了工程化TCR以識別人類白細胞抗原（HLA）呈遞的肽抗原與抗CD3 scFv的TCEs，實現(xiàn)對細胞內(nèi)TAAs的靶向。值得注意的是，短暫存在的ImmTAC tebentafusp，它包含一個針對由HLA-A*02:01呈遞的黑色素細胞譜系特異性抗原糖蛋白（gp100）表位的可溶性TCR融合到CD3靶向scFv，已在2022年被批準用于治療葡萄膜黑色素瘤，為TCEs在實體瘤中的細胞內(nèi)靶標空間開辟了新的領(lǐng)域。

值得注意的是，tebentafusp介導了總體生存益處，盡管它只誘導了少數(shù)臨床反應(yīng)，因此直接殺死腫瘤細胞可能不是其唯一的MoA。與此同時，各種基于重組TCR或使用類似TCR的抗體（TCR模擬物）的TCEs已進入臨床開發(fā)，包括針對WT1和突變新抗原如KRAS122或p53的TCEs。重要的是，高通量動力學篩選和通用TCR類似庫可以促進高度選擇性的TCR和TCR模擬物的開發(fā)，用于TCEs。有趣的是，使用共價KRASG12C抑制劑sotorasib，可以產(chǎn)生一種類似TCR的TCE，可以特異性識別HLA呈遞的sotorasib-肽共軛物，并隨后誘導KRASG12C突變細胞的T細胞殺傷。細胞因子釋放綜合征的發(fā)生，主要是由于靶向T細胞激活，一直是TCEs臨床開發(fā)的一個主要挑戰(zhàn)。盡管在許多情況下，這可以通過使用類固醇預(yù)處理和逐步劑量增加來管理，但最近的努力已經(jīng)研究了使用具有降低CD3ε親和力的CD3ε抗體，目標是將T細胞殺傷與細胞因子分泌解耦。與CAR-T細胞一樣，由于TCEs的殺傷效力非常高，因此需要嚴格腫瘤特異性和/或譜系特異性表達目標抗原，以避免靶向非腫瘤毒性。對于血液癌癥中的B細胞和漿細胞抗原，如CD19、CD20、CD79b、BCMA140141和FcRH5，通常認為它們只存在于B細胞和漿細胞惡性腫瘤以及非必需的B細胞和漿細胞譜系中。然而，即使對于CD19等抗原，其在正常組織中的表達可能并非絕對不存在，有報道稱CD19在圍繞內(nèi)皮細胞的壁細胞/血管周細胞上表達，這些細胞對血腦屏障完整性至關(guān)重要，作為一種靶向非腫瘤機制與神經(jīng)毒性有關(guān)。

相比之下，在急性髓系白血病中，典型的抗原如CD33或CD123也存在于髓系造血譜系上，使得它們的臨床開發(fā)更具挑戰(zhàn)性。類似地，許多主要的（上皮）實體瘤抗原如EGFR、HER2、EpCAM、腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白2（也稱為細胞表面糖蛋白Trop-2）、MUC1、CEACAM5和glypican 3也可以在（必需的）正常組織中找到。因此，由于更免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，TCEs（和CAR-T細胞）在實體瘤的開發(fā)在過去幾年中進展較少。重要的是，必須認識到對于TCEs，與ADCs150相比，由于更高的效力，對腫瘤選擇性的要求更嚴格，固體瘤ADC靶標如HER2和TROP-2可能無法用傳統(tǒng)的TCEs靶向。

與此同時，與TCEs相比，ADCs可能由于在腫瘤微環(huán)境中釋放有毒載荷而受益于更強的旁觀者殺傷效應(yīng)，對抗原陰性腫瘤細胞進行殺傷。因此，很少有腫瘤選擇性抗原似乎是TCEs的可行靶標，包括新抗原如p95-HER2和EGFRvIII，或者MUC16、claudin 18.2、DLL3和STEAP1等靶標。對于DLL3靶向的TCE tarlatamab，目前正在美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的優(yōu)先審查中，已在小細胞肺癌中報告了有希望的I期臨床數(shù)據(jù)，總反應(yīng)率達到23%。隨后的II期研究證實了活動性，持久的客觀反應(yīng)和有希望的生存結(jié)果，使用每2周10毫克劑量治療的患者�；�于這些數(shù)據(jù)，已啟動了一項隨機關(guān)鍵研究，比較tarlatamab與標準護理（NCT05740566）。

同樣，xaluritamig，一種2+1 STEAP1 TCE，具有親和力驅(qū)動的活性，能夠選擇性地針對高表達STEAP1的腫瘤細胞與正常細胞相比，已在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者的I期劑量遞增研究中展示了有希望的臨床活性。綜上所述，這些概念驗證數(shù)據(jù)表明，TCEs僅限于血液癌癥活躍的共同假設(shè)，特別是B細胞惡性腫瘤，并不適用，并且TCEs也有可能治療某些實體瘤，只要能夠管理靶向非腫瘤活性。正在使用多種方法來克服實體瘤選擇性挑戰(zhàn)。例如，在雙特異性抗體中使用具有降低親和力的腫瘤抗原結(jié)合物（2+1格式）可以實現(xiàn)親和力介導的選擇性增益（也稱為親和力調(diào)節(jié)），目標是利用腫瘤和正常組織之間的表達差異，如CEACAM5、HER2和FOLR1，以提高腫瘤選擇性�；蛘�，雙重靶向和親和力介導的選擇性增益應(yīng)用于三特異性TCEs，這些TCEs選擇性地殺死共同表達這些靶標的腫瘤細胞，但不會影響只表達這些靶標中一個的正常細胞。此外，針對兩種不同的腫瘤抗原如CD19和CD22的三特異性TCEs可以防止通過抗原丟失的免疫逃逸。盡管大多數(shù)傳統(tǒng)的TCEs可以招募常規(guī)T細胞和非傳統(tǒng)先天樣γδ T細胞（表達TCRγ/δ而非TCRα/β的T細胞），但一類特定的γδ TCEs已被設(shè)計為通過TCRγδ特別招募γδ T細胞，目標是通過只針對可以在患者中進一步擴展的T細胞亞群來提高安全性和有效性。在臨床前研究中，γδ TCEs作為單一藥物顯示出強大的抗腫瘤活性�；蛘撸瑸榱舜四康�，制造了針對腫瘤的雙特異性異二聚體BTN2A1和BTN3A1抗體融合蛋白。由于γδ T細胞生物學在小鼠模型中沒有完全反映，這種方法的最終概念驗證將不得不依賴于正在進行的臨床試驗的臨床數(shù)據(jù)，如針對PSMA的γδ TCE LAVA-1207（NCT05369000）。而不是針對CD3ε或TCRα/β的雙特異性抗體，肽-MHC復(fù)合物可以被應(yīng)用來特別招募特定pMHC復(fù)合物的T細胞，如由于自然發(fā)生和普遍的巨細胞病毒感染而存在的巨細胞病毒衍生肽。在另一種方法中，病毒表位可以被傳遞到腫瘤細胞中，以便加載相應(yīng)的MHC分子，并招募病毒特異性T細胞攻擊這些細胞。還描述了用于更有效介導雙特異性抗體介導的聚集和補體依賴性細胞毒性的雙特異性抗體。有趣的是，通過應(yīng)用兩對獨立的抗體，可以建立一種邏輯門，通過補體依賴性細胞毒性選擇性地消除共表達兩種抗原的細胞。例如，使用這種方法，可以消除共表達CD20和CD52的B細胞，而單獨表達這些抗原的細胞則不會被殺死。

隨著對采用CAR-T細胞療法的極大興趣，一類特定的TCEs，作為CAR-T細胞和腫瘤細胞之間的雙特異性適配器，已被設(shè)計為特別招募采用轉(zhuǎn)移的T細胞用于治療各種癌癥，同時不涉及自然T細胞。其中一個例子是合成激動性受體（SAR）-T細胞系統(tǒng)，其中一種雙特異性抗體識別腫瘤抗原和一個引入到采用轉(zhuǎn)移的T細胞中的合成抗原受體。這種在合成生物學背景下的方法提供了多種方式。進一步工程化和控制采用T細胞療法方法，超出了傳統(tǒng)抗體療法或經(jīng)典CAR-T細胞療法所能提供的范圍。另一種結(jié)合細胞療法和雙特異性抗體的方法是體外武裝T細胞與多種TCEs，目標是克服腫瘤異質(zhì)性。為此，T細胞在體外與針對腫瘤抗原如GD2、HER2、PSMA和STEAP1的TCEs孵育，并給藥于腫瘤攜帶動物，在這些動物中，由于抗原丟失，它們阻止了腫瘤進展。固有細胞招募劑 盡管TCEs在效應(yīng)細胞招募劑領(lǐng)域占據(jù)主導地位，但正在大力開發(fā)下一代ICEs，包括NKCEs和雙特異性抗體，這些抗體招募髓系衍生細胞（MDCs）進行吞噬作用，包括中性粒細胞和巨噬細胞/單核細胞。介導ADCC的單克隆抗體，如利妥昔單抗、西妥昔單抗或曲妥珠單抗，因為ADCC/抗體依賴性細胞吞噬作用對其MoA至關(guān)重要，除了其他作用如信號抑制外，可以被視為第一代ICEs。基于這種經(jīng)驗，已經(jīng)批準了幾種與常規(guī)單克隆抗體相比具有增強ADCC功能的Fc工程化IgG1抗體，包括obinutuzumab、mogamulizumab、tafasitamab、margetuximab和amivantamab。

基于這種經(jīng)驗和目標，進一步增強ADCC功能，超越Fc工程化IgG1抗體，已經(jīng)開發(fā)了各種雙特異性NKCEs，它們針對自然殺傷細胞上的不同表面分子，如CD16、NKG2D、NKp46或NKp30，作為免疫療法。這些NKCEs中最先進的是一種短半衰期的CD30×CD16雙特異性抗體，用于治療霍奇金淋巴瘤，可以作為單一療法、與檢查點抑制聯(lián)合或與自然殺傷細胞輸注聯(lián)合使用。最近，開發(fā)了針對抗原如EGFR或BCMA的半衰期延長的四價IgG基雙特異性抗體，以及利用雙重靶向?qū)崿F(xiàn)腫瘤選擇性的三特異性抗體。對稱的三特異性NKCEs通過ADCC特別針對通過其CD16結(jié)合區(qū)域共表達EGFR和PDL1的細胞，使用兩種合一抗體技術(shù)。另一種激活自然殺傷細胞的方法依賴于雙特異性融合蛋白，該蛋白由NKG2D配體（例如UL-16結(jié)合蛋白2（ULBP2））與針對HER2的scFv融合，以實現(xiàn)有效的ADCC介導的腫瘤細胞殺傷。或者，保留FcγRIII結(jié)合的雙特異性抗體，針對NKp46或NKp30和各種腫瘤抗原，可以提供強大的抗腫瘤效果。與TCEs不同，其中FcγR結(jié)合是不需要的，這些雙特異性抗體依賴于保留或增強的FcγRIII結(jié)合，以實現(xiàn)有效的自然殺傷細胞參與。值得注意的是，當IL-2變體被融合到NKp46雙特異性抗體上，產(chǎn)生四功能分子時，由于同時誘導自然殺傷細胞擴增，效果大大增強。另一個積極研究的領(lǐng)域是雙特異性抗體，這些抗體通過結(jié)合，例如，巨噬細胞和中性粒細胞上的FcαRI受體（CD89）或通過雙特異性IgE抗體的IgE受體，參與吞噬作用或MDCs以及中性粒細胞的殺傷�；蛘�，腫瘤靶向雙特異性抗體可以阻斷腫瘤細胞上基于'不要吃我信號'的CD47–SIRP1α相互作用，以便這些細胞被MDCs攻擊和吞噬。雙特異性CD19 x CD47或間皮素x CD47抗體結(jié)合了腫瘤靶向和CD47抑制以及通過效應(yīng)功能完整的Fc部分招募效應(yīng)細胞。在這種情況下，對CD47具有低親和力的雙特異性抗體有利于克服不必要的結(jié)合到紅細胞上的CD47。各種團隊應(yīng)用這一概念進行PDL1×CD47共靶向�；蛘撸琒IRPα融合蛋白可以用來阻斷CD47–SIRPα“不要吃我”信號。共刺激雙特異性抗體 有效、持久且局部限制的抗腫瘤免疫反應(yīng)需要共刺激和共抑制信號來緊密調(diào)節(jié)細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的激活、分化和維持。TNFRSF家族成員（如4-1BB、CD40、OX40、TNFRSF18（也稱為糖皮質(zhì)激素誘導的TNFR相關(guān)蛋白（GITR））、CD27或CD30）以及CD28免疫球蛋白超家族（如CD28、CTLA4、PD1、誘導性T細胞共刺激因子（ICOS）和B淋巴細胞和T淋巴細胞衰減因子（BTLA））及其相應(yīng)的配體，在通過細胞-細胞接觸（如抗原呈遞細胞（APCs）和T細胞之間）提供的局部免疫調(diào)節(jié)信號中發(fā)揮著顯著作用。這些受體為T細胞提供了所謂的信號2，這對于維持TCR通過肽-MHC-TCR相互作用或通過TCE交聯(lián)TCR所提供的信號1是必需的。針對這些免疫調(diào)節(jié)途徑的靶向可能增強免疫療法。研究表明，針對共刺激受體的激動性單克隆抗體通常只會導致微弱的激活，但這種激活可以通過FcγR介導的受體超聚集顯著增加。此外，抗體與受體之間的化學計量比、結(jié)合親和力和表位特異性等因素可以影響共刺激抗體的活性。因此，降低免疫調(diào)節(jié)抗體的親和力可以作為一種策略，通過增加受體聚集來增強激動性活性，這一原則經(jīng)常應(yīng)用于雙特異性抗體激動劑（見上文）。然而，由于增加的趨化因子和細胞因子產(chǎn)生導致的免疫相關(guān)系統(tǒng)性不良事件是共刺激抗體藥物開發(fā)的限制因素�？贵w-細胞因子融合蛋白和雙特異性抗體能夠以目標依賴的方式提供共刺激信號，通過雙重靶向兩種不同的共刺激受體或通過靶向共刺激受體和CPI來規(guī)避這一限制。腫瘤靶向共刺激雙特異性抗體 用一個臂結(jié)合到TAA上，另一個臂結(jié)合到免疫細胞上的共刺激受體上的雙特異性抗體，可以通過在癌細胞和免疫細胞之間跨作用來局部介導受體聚集，從而提供信號2。目前正在臨床試驗中的共刺激雙特異性抗體包括針對4-1BB、CD40和CD28的分子。T細胞激活后誘導表達的4-1BB使其成為增強CD8 T細胞反應(yīng)的T細胞共刺激的有吸引力的靶標。使用針對4-1BB的激動性抗體（如urelumab和utomilumab）作為單一療法在臨床試驗中的安全性問題和較差的療效，使人們重新將努力集中在可以克服這些毒性的雙特異性抗體上，通過引入腫瘤特異性共刺激。大約一半的癌癥靶向共刺激雙特異性抗體在臨床試驗中通過4-1BB發(fā)揮作用。先進的雙特異性抗體包括PRS-343（cinrebafusp），一種針對HER2和4-1BB的四價雙特異性抗體-抗鈣蛋白融合蛋白，在IND使能研究中被發(fā)現(xiàn)耐受性良好，沒有明顯和相關(guān)藥物相關(guān)毒性；FAP-4-1BBL（RG7872），作為單一療法和與PDL1抑制聯(lián)合使用時顯示出藥理活性；或englumafusp alfa，正在研究中作為與glofitamab聯(lián)合用于DLBCL的信號2提供者。其他在臨床試驗中通過4-1BB進行腫瘤選擇性共刺激的雙特異性抗體目標包括EGFR、PSMA、CLDN18.2、B7H4、CEACAM5、HER2、PDL1（見下文）和FAP48。此外，使用CD28作為共刺激受體的雙特異性抗體，目前在臨床試驗中。通過與APC上的CD80（也稱為B7.1）或CD86（也稱為B7.2）的結(jié)合，CD28為幼稚T細胞提供了必要的二次信號，以實現(xiàn)完全的T細胞激活和存活。這種信號也可以通過激動性CD28抗體提供，即使在沒有初級TCR參與的情況下，如超激動劑TGN1412所示，它在I期研究中因大量細胞因子釋放綜合征而顯著失敗。后來發(fā)現(xiàn)，TGN1412特別在低劑量下作用于調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞），而在高劑量下激活傳統(tǒng)T細胞和Treg細胞，為選擇性靶向T細胞亞群提供了窗口，但也突出了T細胞共刺激與超激活之間的微妙平衡。一些雙特異性抗體可以以目標依賴的方式提供這種二次共刺激信號，以增強腫瘤限制性的抗腫瘤T細胞反應(yīng)。值得注意的是，雙特異性抗體可以被設(shè)計為單獨使用時活性有限且無毒性，但可以增強T細胞激活和TCEs的抗腫瘤活性。REGN5837是一種針對CD22和CD28的雙特異性抗體，已進入與針對CD20的TCE odronextamab聯(lián)合用于NHL治療的I期試驗。腫瘤靶向CD28雙特異性抗體也可以與PD1協(xié)同作用，提供長期抗腫瘤免疫反應(yīng)，目前，多個針對TAAs如EGFR、MUC16、PSMA、B7-H3、CD19、CD22或PDL1的雙特異性抗體正在進行臨床試驗，與檢查點抑制聯(lián)合使用或作為單一療法。MDCs和樹突細胞激活雙特異性抗體 CD40在包括APCs、其他MDCs和B細胞在內(nèi)的多種細胞類型中表達，但也在廣泛的惡性細胞上表達。單克隆激動性CD40抗體可以通過誘導APCs成熟和激活抗原特異性T細胞和其他免疫細胞來觸發(fā)抗腫瘤效應(yīng)，從而促進腫瘤特異性免疫反應(yīng)，特別是通過啟動細胞毒性T細胞。除了具有劑量限制毒性的激動性CD40抗體外，還開發(fā)了針對CD40和各種TAAs如CEACAM5、EpCAM或間皮素的雙特異性抗體。與其他TNF超家族成員一樣，受體聚集在受體激活中起著關(guān)鍵作用。將CD40激動性抗體與針對腫瘤靶向抗原的抗體結(jié)合在雙特異性抗體中，允許共刺激活性定向到TME，從而提高安全性和有效性。例如，針對CD40和CEACAM5或EpCAM的四價雙特異性抗體的概念驗證表明，與單一CD40抗體相比，它們增強了T細胞交叉啟動。針對間皮素和CD40的雙特異性抗體（ABBV-428）在體外和體外模型中展示了增強的APC和T細胞激活，并且在I期試驗中顯示出可接受的安全性概況。為了在腫瘤內(nèi)而不是外周選擇性激活CD40，生成了FAP×CD40，一種包含兩個CD40結(jié)合位點和一個FAP結(jié)合位點的雙特異性抗體。該抗體提供了一個強烈的FAP依賴性CD40刺激信號，展示了良好的安全性概況以及腫瘤積聚和腫瘤內(nèi)免疫激活，目前正在進行I期臨床試驗。MP-0317是一種多功能設(shè)計ankyrin重復(fù)蛋白（DARPin），應(yīng)用相同的概念，針對FAP、CD40和HSA進行半衰期延長，目前正在進行I期臨床研究�；蛘撸�雙特異性抗體可以通過Clec12a標記物直接靶向樹突細胞。雙特異性抗體的雙重共刺激 在免疫細胞上雙重靶向兩種不同的共刺激受體已被用于誘導強大的抗腫瘤反應(yīng)。FS120是一種針對活化T細胞上表達的4-1BB和OX40的四價雙特異性抗體，以一種不依賴FcγR的方式激活CD4和CD8 T細胞。這種活性需要兩個受體的共刺激才能有效激活免疫細胞并發(fā)揮抗腫瘤活性，支持使用四價雙特異性抗體雙重靶向共刺激受體以誘導有效的受體聚集和激活的概念。在動物研究中，F(xiàn)S120的替代品沒有引起肝臟炎癥和肝毒性，這是激動性4-1BB抗體觀察到的限制。FS120目前正在進行I期臨床試驗。類似的方法中，開發(fā)了一種雙價雙特異性抗體，用于雙重靶向4-1BB和CD40（BNT-312，tecaginlimab），因此靶向T細胞和APCs。APCs的CD40激活導致共刺激分子的上調(diào)和免疫刺激性細胞因子的分泌，從而在不依賴CD4 T細胞幫助的情況下，實現(xiàn)強大的CD8 T細胞介導的抗腫瘤免疫反應(yīng)。雙特異性抗體用于雙重檢查點抑制和共刺激 抗共刺激受體的抗體還被與CPIs結(jié)合使用，以釋放T細胞免受抑制信號的影響，同時增強T細胞反應(yīng)，特別是在對檢查點抑制有抵抗力或難治性的腫瘤中。大多數(shù)目前正在臨床試驗中的雙特異性抗體使用跨作用的方式結(jié)合這些信號，通過靶向腫瘤細胞上的PDL1和免疫細胞上的共刺激受體，其中4-1BB是最突出的靶標。超過十種不同的針對PDL1和4-1BB的雙特異性抗體正在進行I期或II期試驗。II期候選物包括一種IgG-anticalin融合蛋白（PRS-344），其中配體結(jié)合anticalin框架代表第二特異性，一種雙價雙特異性IgG抗體（acasunlimab，也稱為GEN1046）和一種三價，三特異性單鏈二抗體-scFv融合蛋白，進一步包含一個HSA結(jié)合位點以延長半衰期（NM21-1480）。這些類型的雙特異性抗體可以增強免疫反應(yīng)，超越單一抗體及其組合，進一步提供針對PDL1表達腫瘤細胞的靶向共刺激，以及TME中的MDCs和腫瘤引流淋巴結(jié)。與此一致，TME中表達4-1BB的腫瘤浸潤CD8 T細胞亞群表達高水平的PD1，因此容易受到PDL1×4-1BB雙特異性抗體的治療。值得注意的是，由于4-1BB信號需要超聚集，與PDL1的結(jié)合可以導致TME中條件聚集和激活的4-1BB，減少肝臟毒性，如四價雙特異性IgG-scFv（ABL503）所示。遵循這一概念的進一步雙特異性抗體包括四價雙特異性單克隆抗體（FS222）和雙價雙特異性IgGs，如MCLA-145。同樣，CD28共刺激和檢查點抑制可以通過在腫瘤內(nèi)順式作用的T細胞雙重靶向進一步實現(xiàn)。ATOR-1015的可行性已得到證明，它是一種針對OX40的IgG，融合到針對CTLA4的優(yōu)化版本的V型域的CD86上。與4-1BB類似，CTLA4和OX40在活化的T細胞上上調(diào)，并由Treg細胞表達，特別是在TME中。與GITR和ICOS不同，CD27由naive T細胞表達，因此有助于促進新的T細胞反應(yīng)。PDL1×CD27雙特異性抗體在臨床前研究中比PD1阻斷和CD27共刺激的組合更有效，同時展現(xiàn)出良好的安全性概況。在概念上類似的方法中，PD1的結(jié)合位點與其他TNF超家族的共刺激成員結(jié)合，包括4-1BB（如與IBI319結(jié)合）、GITR和ICOS（XmAb23104）。GITR也在活化的T細胞上上調(diào)，并由Treg細胞恒定表達，在其中發(fā)揮著增強初始免疫反應(yīng)的關(guān)鍵作用。

PD1×GITR-L雙特異性融合蛋白的概念驗證已經(jīng)展示。對于這些藥物中的一些，與聯(lián)合或分別協(xié)同效應(yīng)相比，檢查點抑制的相對貢獻并不一定確立。新興概念 支持雙特異性抗體開發(fā)的概念從早期探索性方法迅速發(fā)展到臨床開發(fā)，雙特異性抗體現(xiàn)在已確立為治療原則。然而，雙特異性抗體領(lǐng)域仍在不斷進展，以進一步探索和擴展技術(shù)和應(yīng)用。學術(shù)界以及生物技術(shù)和制藥工業(yè)追求的各種早期探索性雙特異性抗體方法是有希望的，其中一部分可能提供尚未由當前開發(fā)中的雙特異性抗體解決的治療概念。本綜述的范圍不允許我們涵蓋所有或許多這樣的早期方法，實際上在這個快速增長的領(lǐng)域中可能無法全面覆蓋。因此，我們通過提及一些我們認為相關(guān)并有潛力進一步推動基于雙特異性抗體的癌癥治療界限的新興主題來結(jié)束我們的綜述。三特異性TCEs與集成共刺激 共刺激信號可以與雙特異性TCEs結(jié)合，以促進有效的T細胞激活。這已經(jīng)通過上述的雙特異性TCEs和共刺激雙特異性抗體的組合實現(xiàn)，但也通過在雙特異性TCE中包含第三個結(jié)合位點來針對共刺激受體，從而生成三特異性抗體。目前有兩種這樣的三特異性TCE正在進行臨床試驗，它們針對TAA和CD3，并進一步包含一個針對CD28的結(jié)合位點。SAR443216是一種三價三特異性免疫球蛋白基抗體，針對HER2×CD3×CD28，包含一個突變的IgG4，缺乏Fc介導的效應(yīng)功能。這種三特異性抗體目前正在I期臨床試驗中，能夠激活初級CD4和CD8 T細胞，誘導T細胞增殖，釋放細胞因子和顆粒酶B以及T細胞介導的HER2表達腫瘤細胞的殺傷，包括HER2表達低的細胞。類似地，一種針對在多發(fā)性骨髓瘤中過度表達的CD38的結(jié)合位點與CD3和CD28結(jié)合位點結(jié)合在三特異性抗體SAR442257中，目前也在I期臨床試驗中。前藥方法 一種新興的方法旨在通過提供“安全關(guān)鍵”的特異性作為前藥，在腫瘤處選擇性激活，從而生成具有高度腫瘤特異性功能的雙特異性抗體。一些應(yīng)用于失活抗體以生成前藥并在腫瘤處重新激活的概念如圖4所示。前藥轉(zhuǎn)化為功能性雙特異性抗體可以通過腫瘤微環(huán)境中存在的腫瘤特異性蛋白酶等環(huán)境觸發(fā)因素來實現(xiàn)。例如，具有空間屏蔽的雙特異性抗體可以通過蛋白酶激活。需要腫瘤特異性蛋白酶表達的蛋白酶激活TCEs，即所謂的probodies，需要腫瘤特異性蛋白酶在TME中的表達才能激活。另一種早期階段的雙重腫瘤靶向方法依賴于從兩個具有分裂CD3ε結(jié)合基團的雙特異性抗體中腫瘤特異性組裝功能性CD3ε抗體片段。這些實體需要被設(shè)計為在循環(huán)中作為單獨實體時不活躍，以便它們只在腫瘤抗原結(jié)合和隨后的原位組裝后被激活，如已經(jīng)為半抗體或前藥激活鏈交換（PACE）分子所描述的那樣。這類分子面臨的主要挑戰(zhàn)仍然是以單體形式大規(guī)模生產(chǎn)它們，并防止在沒有目標結(jié)合的情況下過早組裝。通過目標鏈交換介導的分裂型I細胞因子的重建就是一個例子，說明如何實現(xiàn)腫瘤特異性組裝。值得注意的是，最近開發(fā)了一種引入到抗4-1BB抗體結(jié)合位點的ATP依賴性開關(guān)，以增加腫瘤選擇性并避免靶上、靶外毒性。這種開關(guān)使用腫瘤中升高的ATP水平作為觸發(fā)因素，可能也適用于其他結(jié)合實體。

圖4 | 雙特異性抗體領(lǐng)域的新興概念。

a, 帶有集成共刺激的三特異性T細胞招募劑（TCEs），用于通過CD3結(jié)合同時激活T細胞受體（TCR）（信號1）和通過結(jié)合CD28進行共刺激（信號2）。
b, 雙特異性抗體（bsAb）前藥的作用方式。用于生成前藥并重新激活所需作用位點的抗體的一般概念包括：阻斷結(jié)合位點以使抗體失活，以及通過蛋白酶誘導激活被阻斷的抗原結(jié)合位點，對目標環(huán)境（如酸性pH或ATP）的親和性調(diào)節(jié)，以及由于通過高濃度局部富集互補前藥而進行的組裝或交換反應(yīng)。
c, 通過結(jié)合表面抗原（腫瘤相關(guān)抗原（TAA））和降解分子，例如膜E3連接酶，實現(xiàn)蛋白酶體靶向嵌合體（PROTAC）方法，這導致細胞表面目標的內(nèi)化和蛋白酶體降解。
d, 例如通過基因療法將bsAb傳遞到CAR-T細胞中。
e, 細胞因子模擬bsAb觸發(fā)細胞因子受體途徑，如通過將受體域引入立體接近性，模仿細胞因子作用的IL-2Rβ–IL-2Rγ異二聚體。PROTAC雙特異性抗體 另一個新興概念和新的作用機制最近被描述，它使用雙特異性抗體通過靶向降解來滅活與增殖相關(guān)的過程。
類似于新興的雙特異性或多特異性小分子蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）領(lǐng)域，雙特異性抗體可以被設(shè)計為觸發(fā)內(nèi)部化并隨后降解參與癌癥發(fā)展和/或進展的表面蛋白。這樣的雙特異性抗體同時結(jié)合到被靶向降解的蛋白質(zhì)，以及觸發(fā)結(jié)合目標蛋白的內(nèi)部化和隨后降解的因素，如膜可及的E3泛素連接酶或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。目前還沒有已知的抗體-PROTAC概念進入臨床研究，但這類實體的開發(fā)與“標準”雙特異性抗體的開發(fā)完全兼容，并為靶向新途徑并盡快將其概念帶入臨床提供了獨特的可能性。

雙特異性抗體的傳遞 
雙特異性抗體發(fā)展的另一個重要新興概念是局部生產(chǎn)和隨后的局部傳遞雙特異性抗體，例如通過脂質(zhì)納米粒子介導的mRNA傳遞CLADN6 TCE，溶瘤病毒或類似基因療法的方法，包括CAR-T細胞。細胞因子模擬抗體 最后，雙特異性抗體也可以作為細胞因子模擬物或所謂的合成細胞因子激動劑。在這種情況下，已經(jīng)描述了scFvs或基于單一結(jié)構(gòu)域Vhh的方法，通過模仿IL-2或IL-15、IL-18、I型干擾素和IL-10有效地觸發(fā)細胞因子信號�；蛘�，可以通過使用分裂方法使用新設(shè)計的IL-2模擬蛋白neoleukin實現(xiàn)腫瘤特異性細胞因子受體激動活性。這種基于抗體的細胞因子模擬物在癌癥免疫療法中可能有各種應(yīng)用。

展望 
雙特異性抗體領(lǐng)域近年來取得了顯著進展，到2023年底，已有十多種雙特異性抗體獲得批準，許多不同的方法正在臨床測試中。然而，我們認為，由于癌癥的異質(zhì)性和適應(yīng)性，這些方法中不太可能有一種成為通用的癌癥免疫療法。相反，抗體將需要為特定應(yīng)用量身定制，并將依賴于與其他方法的結(jié)合，以最大化它們的療效和安全窗口。具有多重特異性的抗體治療的發(fā)展增長可能會在未來幾個領(lǐng)域發(fā)生：針對具有明確依賴性的腫瘤的腫瘤相關(guān)RTKs的雙特異性抗體；用于以增加的選擇性靶向腫瘤的雙特異性ADCs；用于靶向降解適用于各種途徑的細胞表面蛋白的雙特異性PROTACs；以及用于癌癥免疫療法的多特異性抗體。在后一個領(lǐng)域，特別是對于非常有效的基于T細胞的療法，如TCEs或CAR-T細胞，識別高度腫瘤選擇性抗原將是至關(guān)重要的，將需要能夠通過腫瘤特異性蛋白酶激活和更好地調(diào)節(jié)效應(yīng)功能來特別實現(xiàn)腫瘤特異性活性，同時保護正常組織。

另一個重要方面是提供雙重檢查點抑制和/或補充共刺激信號給T細胞，以維持和延長T細胞反應(yīng)，如已被證明對CAR-T細胞療法的臨床成功至關(guān)重要。重要的是，這種方法不僅適用于與TCEs的組合，也適用于與內(nèi)源性免疫方法的組合。另一個重要方面是通過激活先天免疫系統(tǒng)，包括自然殺傷細胞、MDCs和樹突細胞，促進二次免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。與其他癌癥藥物一樣，通過改進的診斷方法和新的發(fā)展范式，使雙特異性抗體和多特異性基于抗體的治療能夠在疾病早期應(yīng)用于患者將是實現(xiàn)治愈癌癥患者目標的關(guān)鍵。