近年來，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法（ICB）在對抗癌癥方面取得了很大進(jìn)展。CTLA-4單抗是首個獲批上市的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。作為一種抑制性檢查點(diǎn)，CTLA-4在活化T細(xì)胞和腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞上高表達(dá)。CTLA-4單抗不僅能夠增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的功能，還能清除腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞。然而，部分患者無法響應(yīng)CTLA-4單抗治療，而且治療還會產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)。

腫瘤細(xì)胞為了維持生存會進(jìn)行大量的有氧糖酵解，導(dǎo)致乳酸在腫瘤微環(huán)境中過度積累。目前已知Treg細(xì)胞利用乳酸來維持其免疫抑制功能�？紤]到CTLA-4在Treg細(xì)胞中的重要性，乳酸是否調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞中CTLA-4的表達(dá)，進(jìn)而影響對CTLA-4阻斷療法的應(yīng)答，這個問題值得深入探究。

近日，上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鄒強(qiáng)研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，乳酸通過RNA剪接機(jī)制促進(jìn)腫瘤浸潤Treg細(xì)胞中CTLA-4的表達(dá)，有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Immunity》雜志上，確定了Treg細(xì)胞中乳酸與RNA剪接之間的機(jī)制關(guān)聯(lián)，對自身免疫和抗腫瘤免疫具有治療方面的意義。
 

圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了多種條件性基因敲除小鼠模型（其中Slc16a1-floxed小鼠由賽業(yè)生物提供），以研究MCT1、USP39和CTLA-4蛋白的功能和關(guān)聯(lián)。他們利用Treg細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了乳酸攝取對轉(zhuǎn)錄程序的影響。在分析蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，他們采用了RNA免疫沉淀（RIP）以及CUT&RUN方法。在體外實(shí)驗(yàn)中，他們還從小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中純化出初始CD4+ T細(xì)胞，并誘導(dǎo)其分化為Treg細(xì)胞。

技術(shù)路線
01 敲除小鼠Treg細(xì)胞中的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以分析乳酸攝取對CTLA-4阻斷療法的影響
02 敲除小鼠Treg細(xì)胞和腫瘤浸潤Treg細(xì)胞中的USP39，以分析USP39的功能作用
03 探索乳酸攝取對Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的影響，分析USP39缺失是否改變RNA剪接
04 確定乳酸影響RNA剪接和CTLA-4表達(dá)的分子機(jī)制

研究結(jié)果
1. Treg細(xì)胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果
乳酸是由Treg細(xì)胞中的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MCT1）轉(zhuǎn)運(yùn)的。為了探討Treg細(xì)胞對乳酸的利用是否會影響CTLA-4阻斷療法，研究人員將Slc16a1-floxed小鼠（由賽業(yè)生物提供，MCT1由Slc16a1基因編碼）與Foxp3-Cre-YFP小鼠雜交，構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠（Slc16a1fl/flFoxp3-Cre），其Treg細(xì)胞中的Slc16a1被特異性敲除。

他們發(fā)現(xiàn)，CTLA-4抗體治療能有效阻止瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的聚集，并激發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。不過，Slc16a1fl/flFoxp3-Cre荷瘤小鼠對CTLA-4抗體治療未產(chǎn)生應(yīng)答，它們在接受或未接受抗體治療的情況下，腫瘤生長和抗腫瘤免疫并無明顯差異，表明Treg細(xì)胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果（圖1）。
 

圖1 Treg細(xì)胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果[1]

2. RNA剪接機(jī)制與腫瘤浸潤Treg細(xì)胞特征有關(guān)
為了探索乳酸攝取對Treg細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄程序有何影響，研究人員分析了結(jié)直腸癌中Treg細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞來源的RNA剪接過程與SLC16A1 mRNA的表達(dá)相關(guān)，且腫瘤浸潤Treg細(xì)胞的RNA剪接相關(guān)通路特征打分高于外周Treg細(xì)胞。此外，SLC16A1的表達(dá)與泛素特異性蛋白酶39（USP39）的表達(dá)呈正相關(guān)，而USP39是RNA剪接機(jī)制的組分之一。這些結(jié)果表明，Treg細(xì)胞中的RNA剪接與腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞特征有關(guān)。

3. USP39通過CTLA-4維持Treg細(xì)胞的功能
接下來，研究人員構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠（Usp39fl/flFoxp3-Cre），其Treg細(xì)胞中的Usp39被特異性敲除。他們發(fā)現(xiàn)，這些小鼠出現(xiàn)致命的自身免疫表型，其嚴(yán)重程度與Foxp3缺陷型小鼠和CTLA-4缺陷型小鼠類似，表明Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制存在嚴(yán)重缺陷。此外，USP39缺陷型Treg細(xì)胞無法表達(dá)Treg細(xì)胞的特征基因，包括Foxp3、Ctla4、Pdcd1和Il10。這些結(jié)果表明，USP39缺失會破壞Treg細(xì)胞身份，導(dǎo)致致命的自身免疫。

他們之后特異性敲除了腫瘤浸潤Treg細(xì)胞中的USP39，發(fā)現(xiàn)USP39的破壞明顯抑制了腫瘤進(jìn)展并提高了小鼠的存活率。在USP39缺陷型Foxp3+ Treg細(xì)胞中，CTLA-4的表達(dá)較低。他們還進(jìn)一步敲除了小鼠Treg細(xì)胞中的CTLA-4和USP39，發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制腫瘤生長并促進(jìn)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。不過在Ctla4fl/flFoxp3CreERT2荷瘤小鼠中，USP39缺失卻不會改變腫瘤生長或抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，表明USP39通過CTLA-4維持Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。

4. USP39促進(jìn)Ctla4 RNA的高效剪接
那么，USP39缺失是否會改變Treg細(xì)胞的RNA剪接模式？轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果表明，USP39缺失會導(dǎo)致1235個剪接事件發(fā)生改變，且USP39缺失導(dǎo)致50個和30個剪接位點(diǎn)的效率降低（圖2），表明USP39對Treg細(xì)胞中的RNA剪接至關(guān)重要。USP39的缺失也導(dǎo)致Ctla4表達(dá)下降。RNA免疫沉淀分析表明，USP39與Ctla4 pre-mRNA結(jié)合（圖2）。此外，USP39缺失會降低腫瘤浸潤Treg細(xì)胞中Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例。這些數(shù)據(jù)表明，USP39是Ctla4 RNA高效剪接所必需的。

圖2 USP39調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的RNA剪接程序[1]

之后，研究人員利用體外系統(tǒng)探索了USP39對Treg細(xì)胞功能基因的RNA剪接有何作用。與對照相比，USP39缺失會降低Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例，但不會改變其他Treg細(xì)胞功能基因的RNA剪接效果，這表明USP39的缺失會選擇性影響Treg細(xì)胞中Ctla4 RNA的剪接。雌性Usp39fl/flFoxp3-Cre/+小鼠的分析也證實(shí)了這一點(diǎn)，由于X染色體的隨機(jī)失活，大約一半的Treg細(xì)胞缺乏USP39。這些結(jié)果表明，USP39介導(dǎo)的RNA剪接是Treg細(xì)胞中CTLA-4表達(dá)所必需的。

5. 乳酸調(diào)節(jié)USP39介導(dǎo)的CTLA-4表達(dá)
最后，研究人員探究了Treg細(xì)胞中乳酸與USP39之間的潛在聯(lián)系。他們在Usp39的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Foxp3的結(jié)合位點(diǎn)。在乳酸處理后，F(xiàn)oxp3+ Treg細(xì)胞中USP39和CTLA-4表達(dá)水平增加，表明乳酸誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)，然后促進(jìn)Treg細(xì)胞中USP39依賴性的CTLA-4表達(dá)。在阻斷乳酸攝取后，Usp39表達(dá)和Ctla4 RNA剪接效率降低，但USP39缺陷型Treg細(xì)胞中Ctla4 RNA剪接的效率沒有改變。這些結(jié)果表明，在腫瘤浸潤Treg細(xì)胞中，乳酸調(diào)節(jié)了USP39介導(dǎo)的CTLA-4表達(dá)。

研究結(jié)論

圖3 Treg細(xì)胞中乳酸與RNA剪接之間的機(jī)制[1]

這項(xiàng)研究表明，乳酸通過調(diào)節(jié)RNA剪接來增加CTLA-4的表達(dá)并增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，這有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這些發(fā)現(xiàn)確定了一種環(huán)境機(jī)制，它能夠維持Treg細(xì)胞內(nèi)RNA剪接機(jī)制的活性，進(jìn)而支持Treg細(xì)胞的功能狀態(tài)和CTLA-4阻斷的應(yīng)答。研究還表明，抑制USP39可能會降低Treg細(xì)胞的抗腫瘤免疫屏障，對腫瘤治療產(chǎn)生影響。

參考文獻(xiàn)：
[1]Ding et al., Lactate modulates RNA splicing to promote CTLA-4 expression in tumor-infiltrating regulatory T cells, Immunity (2024), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019
 

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產(chǎn)品編號：
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應(yīng)用方向：
免疫,腫瘤,代謝等
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