熒光抗體（FA）技術(shù)的各種方法詳細(xì)解讀
免疫熒光染色一直是一種高度可靠和強(qiáng)大的技術(shù)，用于廣泛的研究和診斷目的。
通常，熒光抗體（FA）技術(shù)將涉及使用細(xì)胞或抗體，其恒定區(qū)域已用熒光標(biāo)記標(biāo)記（也稱為熒光團(tuán)）標(biāo)記。FA技術(shù)通常分為直接或間接。
一、直接熒光抗體
直接熒光抗體技術(shù)，也可以稱為直接免疫熒光（DIF），涉及使用單個(gè)熒光標(biāo)記的一抗，用于與靶抗原結(jié)合。當(dāng)臨床使用時(shí)，DIF對于快速診斷細(xì)菌性疾病特別有用，如化膿性鏈球菌（通常稱為鏈球菌）以及肺炎支原體和嗜肺軍團(tuán)菌屬引起的肺炎。
出于這種診斷目的，首先將患者樣本放在顯微鏡載玻片上，然后暴露于熒光抗體中。熒光標(biāo)記抗體和靶抗原（在這些情況下是細(xì)菌）之間的任何結(jié)合都會(huì)導(dǎo)致這些物質(zhì)在用熒光顯微鏡檢查時(shí)發(fā)光。
除了用作診斷工具外，DIF還廣泛用于科學(xué)研究。為此，將切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放置在載玻片上。
然后將載玻片與熒光標(biāo)記抗體一起孵育，熒光標(biāo)記抗體通常包括一組針對IgA，IgG和IgM抗體同種型的抗體以及針對目標(biāo)抗原的補(bǔ)體3。
請注意，用于此類研究的抗體濃度將基于先前的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)已確認(rèn)哪種濃度可以達(dá)到最高的信噪比。
在載玻片在黑暗和室溫下孵育至少30分鐘后，洗滌載玻片，然后用熒光顯微鏡成像。
二、間接熒光抗體
與用于DIF的單步技術(shù)相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個(gè)兩步過程，首先將未標(biāo)記的一抗施加到針對靶抗原的樣品上。IIF的第二步涉及使用熒光標(biāo)記的二抗，該二抗針對一抗的Fc部分。
盡管IIF被認(rèn)為比DIF更復(fù)雜，因?yàn)樗枰L的時(shí)間才能完成并且需要使用兩種兼容的抗體，但它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些常見臨床應(yīng)用包括用于診斷梅毒的測試。對于這種類型的IFA測試，先前從研究動(dòng)物中分離出的T. Palladium細(xì)胞被分離并放置在載玻片的表面上。然后將從患者獲得的血清散布在鈀錐蟲細(xì)胞上，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結(jié)合。
沖洗掉患者的血清樣本后，加入用熒光團(tuán)標(biāo)記的二抗。梅毒陽性結(jié)果將照亮所有二抗-熒光團(tuán)偶聯(lián)物復(fù)合物。
另一種廣泛用于臨床環(huán)境的IFA是用于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自身免疫性疾病，其循環(huán)抗核自身抗體（ANA）水平將增加，這些抗體針對DNA和與DNA結(jié)合的各種蛋白質(zhì)。
對于這種類型的IFA測試，將細(xì)胞培養(yǎng)，然后放置在載玻片上。然后將每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然后洗滌以去除任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)。在洗滌步驟之后，將熒光標(biāo)記的二抗（用于ANA測試）添加到載玻片中并使其孵育。然后從顯示熒光的最高血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用于確定 SLE 診斷。
三、流式細(xì)胞術(shù)
第三種類型的熒光抗體技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)，這是一種自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)，可用于定量存在于復(fù)雜混合物（如血液或血清）中的特定細(xì)胞。
典型的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)將從孵育熒光標(biāo)記的抗體開始，該抗體針對特定的細(xì)胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的糖蛋白CD4結(jié)合，包括T輔助細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)還可以通過使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞制造商來量化多種細(xì)胞類型的存在。
孵育完成后，將樣品引入流式細(xì)胞儀。在這臺(tái)機(jī)器中，狹窄的毛細(xì)管迫使樣品中存在的細(xì)胞在單個(gè)文件中移動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞穿過毛細(xì)管時(shí)，激光用于激活和激發(fā)任何已用熒光團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞。
然后通過正向和側(cè)向散射檢測器測量每個(gè)激發(fā)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并將其描繪在直方圖上進(jìn)行分析。除了定量目的外，流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光都可用于通過稱為熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS）的技術(shù)將細(xì)胞分選為純化的亞群以進(jìn)行研究。
通常，熒光抗體（FA）技術(shù)將涉及使用細(xì)胞或抗體，其恒定區(qū)域已用熒光標(biāo)記標(biāo)記（也稱為熒光團(tuán)）標(biāo)記。FA技術(shù)通常分為直接或間接。
一、直接熒光抗體
直接熒光抗體技術(shù)，也可以稱為直接免疫熒光（DIF），涉及使用單個(gè)熒光標(biāo)記的一抗，用于與靶抗原結(jié)合。當(dāng)臨床使用時(shí)，DIF對于快速診斷細(xì)菌性疾病特別有用，如化膿性鏈球菌（通常稱為鏈球菌）以及肺炎支原體和嗜肺軍團(tuán)菌屬引起的肺炎。
出于這種診斷目的，首先將患者樣本放在顯微鏡載玻片上，然后暴露于熒光抗體中。熒光標(biāo)記抗體和靶抗原（在這些情況下是細(xì)菌）之間的任何結(jié)合都會(huì)導(dǎo)致這些物質(zhì)在用熒光顯微鏡檢查時(shí)發(fā)光。
除了用作診斷工具外，DIF還廣泛用于科學(xué)研究。為此，將切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放置在載玻片上。
然后將載玻片與熒光標(biāo)記抗體一起孵育，熒光標(biāo)記抗體通常包括一組針對IgA，IgG和IgM抗體同種型的抗體以及針對目標(biāo)抗原的補(bǔ)體3。
請注意，用于此類研究的抗體濃度將基于先前的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)已確認(rèn)哪種濃度可以達(dá)到最高的信噪比。
在載玻片在黑暗和室溫下孵育至少30分鐘后，洗滌載玻片，然后用熒光顯微鏡成像。
二、間接熒光抗體
與用于DIF的單步技術(shù)相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個(gè)兩步過程，首先將未標(biāo)記的一抗施加到針對靶抗原的樣品上。IIF的第二步涉及使用熒光標(biāo)記的二抗，該二抗針對一抗的Fc部分。
盡管IIF被認(rèn)為比DIF更復(fù)雜，因?yàn)樗枰L的時(shí)間才能完成并且需要使用兩種兼容的抗體，但它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些常見臨床應(yīng)用包括用于診斷梅毒的測試。對于這種類型的IFA測試，先前從研究動(dòng)物中分離出的T. Palladium細(xì)胞被分離并放置在載玻片的表面上。然后將從患者獲得的血清散布在鈀錐蟲細(xì)胞上，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結(jié)合。
沖洗掉患者的血清樣本后，加入用熒光團(tuán)標(biāo)記的二抗。梅毒陽性結(jié)果將照亮所有二抗-熒光團(tuán)偶聯(lián)物復(fù)合物。
另一種廣泛用于臨床環(huán)境的IFA是用于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自身免疫性疾病，其循環(huán)抗核自身抗體（ANA）水平將增加，這些抗體針對DNA和與DNA結(jié)合的各種蛋白質(zhì)。
對于這種類型的IFA測試，將細(xì)胞培養(yǎng)，然后放置在載玻片上。然后將每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然后洗滌以去除任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)。在洗滌步驟之后，將熒光標(biāo)記的二抗（用于ANA測試）添加到載玻片中并使其孵育。然后從顯示熒光的最高血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用于確定 SLE 診斷。
三、流式細(xì)胞術(shù)
第三種類型的熒光抗體技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)，這是一種自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)，可用于定量存在于復(fù)雜混合物（如血液或血清）中的特定細(xì)胞。
典型的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)將從孵育熒光標(biāo)記的抗體開始，該抗體針對特定的細(xì)胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的糖蛋白CD4結(jié)合，包括T輔助細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)還可以通過使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞制造商來量化多種細(xì)胞類型的存在。
孵育完成后，將樣品引入流式細(xì)胞儀。在這臺(tái)機(jī)器中，狹窄的毛細(xì)管迫使樣品中存在的細(xì)胞在單個(gè)文件中移動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞穿過毛細(xì)管時(shí)，激光用于激活和激發(fā)任何已用熒光團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞。
然后通過正向和側(cè)向散射檢測器測量每個(gè)激發(fā)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并將其描繪在直方圖上進(jìn)行分析。除了定量目的外，流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光都可用于通過稱為熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS）的技術(shù)將細(xì)胞分選為純化的亞群以進(jìn)行研究。
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