本文要點(diǎn)：J-聚集為分子染料帶來了有趣的光學(xué)和電子特性，顯著擴(kuò)展了它們在不同領(lǐng)域的適用性，但合理設(shè)計(jì) J-聚集染料仍然存在挑戰(zhàn)。在此，本文通過逐步細(xì)化一種常見的七甲胺花青的結(jié)構(gòu)，從零開始開發(fā)了大量的 J 聚集染料。通過在染料的介觀位置引入具有芐基和三氟乙�；�的支鏈結(jié)構(gòu)獲得了具有尖銳光譜帶（半峰全寬≤38 nm）的 J 聚集體。微調(diào)芐基可以實(shí)現(xiàn) J 聚集體的光譜調(diào)節(jié)。對9種染料的單晶數(shù)據(jù)的分析揭示了 J 聚集傾向與晶體內(nèi)分子排列之間的相關(guān)性。一些 J 聚集體已成功應(yīng)用于動(dòng)物的多路復(fù)用光聲和熒光成像。值得注意的是，由于 J 聚集體具有清晰而明顯的吸收帶，實(shí)現(xiàn)了高時(shí)空分辨率的三色多光譜光聲斷層掃描成像。

 

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本文逐步調(diào)整了一種常見的七甲胺花青的結(jié)構(gòu)，通過在七亞甲基苯并吲哚菁骨架上引入具有三氟乙�；�和芐基的支鏈介旋取代基，成功地獲得了十幾種具有異常窄光譜帶（半峰全寬≤38 nm）的J-聚集體。此外，通過微調(diào) J 聚集染料上的芐基部分來實(shí)現(xiàn)對光學(xué)性質(zhì)的控制。首先，本文成功地從這些染料中培養(yǎng)出9個(gè)單晶，并分析了它們的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，從而為J聚集體中的堆積排列提供了見解。這項(xiàng)研究能夠評估染料的J聚集傾向與相應(yīng)單晶中的分子排列之間的相關(guān)性。其次，研究者精心挑選了幾個(gè)樣品用于NIR-II雙模和多路（三色）多光譜光聲斷層掃描（MSOT）和熒光成像。本文成功通過高時(shí)空分辨率實(shí)現(xiàn)了多個(gè)器官內(nèi)不同染料的同時(shí)成像。

圖1. 本研究中合成的花青（化合物 1 至 29）及其形成聚集體的能力列表。紅色：能夠形成穩(wěn)定的J-聚集體的花青，與幾乎沒有單體和其他聚集體共存。綠色：花青形成不完美的J聚集體，與相當(dāng)數(shù)量的單體或其他聚集體共存。藍(lán)色：主要形成H聚集體的花青。黑色：本研究中不能形成 J 聚集體和 H 聚集體的花青。

 

本文對 J-聚集的研究始于化合物 1，它是一種七甲胺吲哚菁，在聚亞甲基橋中的環(huán)己烯上具有內(nèi)消旋氯。1的結(jié)構(gòu)修飾涉及幾個(gè)關(guān)鍵步驟，即在中心位置用環(huán)戊烯取代環(huán)己烯部分，在兩個(gè)末端用苯吲哚取代吲哚，將吲哚氮取代基從乙基改變?yōu)榧谆�和丙基，以及逐步改變介消旋取代基。研究者尋求在NIR-II區(qū)域獲得具有吸收帶的良好形成的J聚集體，導(dǎo)致了CYJ1007的出現(xiàn)（由9形成）。這一突破是通過引入由芐基和三氟乙�；�組成的支鏈內(nèi)消旋取代基來實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步微調(diào)芐基部分可以調(diào)節(jié) J 聚集體的光學(xué)特性。最終，研究者得到了 16 種 J 聚集染料，其中 10 種（9、17、19-25 和 28）可以形成形態(tài)良好的聚集體，其光譜幾乎沒有單體跡象，1 （5） 種可以形成 H 聚集體，2種（4 和 6 ）似乎同時(shí)表現(xiàn)出 H 和 J 聚集體的光譜特性。

 

通過將特定 J 聚集染料的 DMSO 溶液加入2-（4-（2-羥乙基）哌嗪-1-基）乙磺酸 （HEPES） 緩沖液中，然后通過離心純化來制備大量 J 聚集體。將所得的 J 聚集體重新分散在 HEPES 緩沖液中，用于光學(xué)研究。染料和J-聚集體的光學(xué)特性如圖2a所示。以化合物 9 為例，比較了單體和 J-聚集體的光學(xué)性質(zhì)（圖 2a–2c）。如圖 2a 所示，化合物 9（單體）具有相對較寬的吸收帶，最長為 878 nm，而其 J 聚集體 （CYJ1007） 在1007 nm 處表現(xiàn)出尖銳、紅移和強(qiáng)烈的吸收帶，以及幾乎重疊的熒光帶。此外，CYJ1007顯示出強(qiáng)烈的丁達(dá)爾效應(yīng)，這是粒子形成的標(biāo)志。如在TEM上觀察到的那樣，顆粒呈現(xiàn)出球形形態(tài)。如圖 2b 所示，J 聚集體的熒光壽命比單體短得多，為 J 聚集體的形成提供了額外的證據(jù)。此外，圓二色性（CD）光譜（圖2c）顯示，單體在600 nm至1200 nm范圍內(nèi)不表現(xiàn)出CD信號，而J聚集體CJY1007在CYJ1007的最大吸收（1007 nm）處顯示出具有強(qiáng)烈、尖銳和負(fù)峰的CD信號，這可能是由J聚集體中的手性排列、激子耦合和/或長程有序引起的。

聚集體的形成相當(dāng)快，如將化合物9的DMSO溶液加入HEPES后10分鐘內(nèi)吸光度突然增加所證明的那樣（圖2d）�；�合物9在30nM至50nM之間的HEPES溶液中也表現(xiàn)出低臨界聚集濃度，同時(shí)在生物體液中具有很強(qiáng)的J聚集傾向。有趣的是，一些單體的吸收光譜幾乎相互重疊（圖2e），而其J聚集體的吸收光譜各不相同，范圍從1007 nm到1059 nm（圖2f）。J聚集體在生理pH值下還表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膒H穩(wěn)定性，比單體具有更好的光穩(wěn)定性，并且在37°C下在100% FBS中具有相當(dāng)?shù)姆�(wěn)定性。為了追求這些 J 聚集體在水性介質(zhì)中的更大穩(wěn)定性，這對于體內(nèi)光學(xué)成像至關(guān)重要，研究者將 J 聚集體封裝在 Pluronic F127 膠束中。值得注意的是，這種封裝僅引起其吸收光譜的微小變化，同時(shí)大大提高了它們的穩(wěn)定性。HEPES中封裝的J聚集體比商業(yè)和報(bào)道的NIR-II分子染料和水性介質(zhì)中的J-聚集體具有更窄的光譜帶。

 

從化合物 10 和 14 開始分析，這兩種化合物都不能形成 J 聚集體�；�合物10采用“人字形”堆疊（圖3a），相鄰堆疊在相反方向上“俯仰”和“滾動(dòng)”，其相鄰分子在堆棧內(nèi)表現(xiàn)出較大的橫向位移（3.57 Å）（圖3a4），因此它們之間的π-π相互作用可以忽略不計(jì)。對于化合物14，其末端基團(tuán)高度扭曲和彎曲，兩個(gè)苯并吲哚平面之間具有較大的二面角（圖3b）。在14中，苯環(huán)直接連接到三氟乙胺基團(tuán)導(dǎo)致較大的空間位阻，使14成為“擁擠”的菁并抵消J聚集。顯然，10 和 14 的單晶中的堆積排列不利于 J 聚集。

化合物8、15、11、9、24和19在單晶中都表現(xiàn)出磚層堆積，其分子堆積排列的特點(diǎn)是縱向位移大，橫向位移小，有利于J聚集體的形成（圖3c-3e）。然而，觀察到化合物 8 和 15 盡管它們在分子結(jié)構(gòu)上與 9 高度相似（8 在介觀取代基處的乙�；�與三氟乙�；�，以及 15 在吲哚氮處的甲基與乙基），但未能形成 J 聚集體，而其他四種 （9、11、24 和 19） 可以。單晶是通過非常緩慢的溶劑擴(kuò)散過程生長的，該過程更像是熱力學(xué)上有利的過程。六種染料在單晶內(nèi)的分子排列表明它們可能具有形成J 聚集體的傾向。然而，與單晶相比，水介質(zhì)中J聚集體的形成更復(fù)雜、更迅速，動(dòng)力學(xué)因素成為J聚集體形成的關(guān)鍵決定因素。8 中介消旋取代基上的乙�；�和 15 中吲哚氮上的甲基與 9 中的對應(yīng)物相比尺寸相對較小。這可能導(dǎo)致 8 和 15 的分子振蕩增加，尤其是當(dāng)放置在水性介質(zhì)中時(shí)，從而降低它們的 J 聚集能力。關(guān)于9、24和19形成的三種單晶，它們都可以形成J聚集體，并且其結(jié)構(gòu)中具有苯吲哚末端基團(tuán)，觀察到它們的層間縱向位移（18.70、19.57和19.95 Å）與相應(yīng)的J聚集體表現(xiàn)出的最大吸收量（1007、1045和1059）之間存在正相關(guān)關(guān)系。

這些結(jié)果表明，單晶內(nèi)的堆積排列與J聚集之間存在有意義的相關(guān)性，這意味著理解單晶內(nèi)的分子堆積可能是評估染料J聚集傾向的寶貴方法�？刂茊尉�內(nèi)分子堆積的各種力和空間位阻因素也可以在J聚集染料的設(shè)計(jì)中得到利用。

 

在 NIR-II 光聲成像中，在 1050 nm 至 1150 nm 的波長范圍內(nèi)工作可以顯著減少來自各種內(nèi)源性吸收劑的干擾，包括水、血紅蛋白、氧合血紅蛋白和脂質(zhì)。因此，本文選擇了樣品CYJ1059@F127進(jìn)行單色成像。

對 J 聚集染料構(gòu)建了一系列染料和 J 聚集體，使研究者能夠進(jìn)行多路熒光和 MSOT 成像（圖 4 和 5）。為了實(shí)現(xiàn)最佳的光譜分離并最大限度地減少三色成像中的串?dāng)_，本文選擇了兩種 J 聚集體（CYJ981@F127 和CYJ1059@F127）和一個(gè)單體（化合物 1，用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 β-LG 處理形成 1@β-LG 用于腎臟靶向).圖4a-i和5a顯示了三種樣品在pH 7.4 HEPES溶液中的吸收和光聲光譜。

小鼠俯臥（圖4b-4d）和仰臥（圖4e-4g）位置進(jìn)行三色熒光成像。對于前者，將CYJ981@F127注射到小鼠后肢的爪子中，而靜脈注射1@β-LG在12分鐘和CYJ1059@F127注射15分鐘進(jìn)行（圖4b）。圖4c、4d和S60顯示了不同激發(fā)波長下的熒光圖像和不同時(shí)間點(diǎn)的合并熒光圖像。正如預(yù)期的那樣，CYJ981@F127表現(xiàn)出通過爪子的淋巴管遷移到淋巴結(jié)。相比之下，發(fā)現(xiàn) 1@β-LG 僅在腎臟中積累，而 CYJ1059@F127 表現(xiàn)出在整個(gè)血液中的全身分布。值得注意的是，通過三色熒光成像可以清楚地辨別出所有三種不同的過程。這歸因于 J 聚集，它使染料單體的光譜帶銳化。

對于仰臥位的小鼠，通過管胃管將CYJ981@F127施用于小鼠胃的底部，而另外兩個(gè)通過靜脈注射引入（圖4e）。在不同波長下進(jìn)行成像，以觀察膀胱（腎臟代謝后）、腸道CYJ981@F127和肝臟中 CYJ1059@F127 的 1@β-LG。同樣，在不同器官內(nèi)的三種染料也被清楚地觀察到，如圖4f、4g所示。

圖5.  1@β-LG （50 μM）、CYJ981@F127 （50 μM） 或 CYJ1059@F127 （50 μM） 注射三組染料三色MSOT成像

 

三色多光譜光聲斷層掃描 （MSOT） 成像是通過將三種染料注入小鼠體內(nèi)并在單次運(yùn)行中用多個(gè) （13） 個(gè)波長照亮每個(gè)樣品（圖 5a）進(jìn)行的，然后進(jìn)行超聲檢測、重建和光譜分離。為了評估在多路 MSOT 成像框架內(nèi)三種染料之間的潛在串?dāng)_，進(jìn)行了一項(xiàng)評估，涉及皮下注射三種單獨(dú)的染料或三個(gè)染料組（標(biāo)記為 I、II 和 III 組，每組包含兩種不同的染料，如圖 5b 所示）到小鼠中。這些注射劑在小鼠的三個(gè)不同部位小心地進(jìn)行，分別位于背部、左腰部和右腰部。評估結(jié)果（圖5c和S62）表明，在這兩種實(shí)驗(yàn)場景中都不存在串?dāng)_。作為一個(gè)說明性的例子，當(dāng)將1@B-LG施用于小鼠的左腰（I組）和右腰（III組）時(shí)，從1@B-LG（左上圖）發(fā)出的MSOT信號精確地定位在左腰部和右腰部，確認(rèn)成像中沒有串?dāng)_（圖5c）。

隨后，進(jìn)行三色MSOT成像，以闡明三種染料給藥后的生物分布，成像過程的時(shí)間線如圖5d所示。將個(gè)體小鼠輕輕麻醉并小心地放置在成像室中進(jìn)行MSOT成像，其持續(xù)時(shí)間為-6分鐘至62分鐘。在0 min和10 min時(shí)，分別通過尾靜脈將CYJ981@F127和1@β-LG注射到小鼠胃中，而在20 min時(shí)通過管飼管將CYJ1059@F127遞送至小鼠胃底部。通過掃描小鼠腹部區(qū)域的特定部分獲得一堆橫截面（2D）MSOT圖像，這些橫截面圖像可以單獨(dú)檢查或渲染成3D表示（最大強(qiáng)度投影，MIP）。圖5e顯示了小鼠的冷凍切片圖像，其橫截面位置與圖5f中的橫截面位置相對應(yīng)。通過記錄每種染料的信號，可以監(jiān)測三種染料的生物分布，如單通道和復(fù)合圖像所示（圖5f）。顯而易見的是，1@β-LG選擇性地在兩個(gè)腎臟內(nèi)積累，而CYJ981@F127和CYJ1059@F127分別位于肝臟和腸道中。兩個(gè)感興趣區(qū)域的三色MSOT成像進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果。此外，圖5g中的3D MSOT圖像提供了與三種染料分布相關(guān)的空間信息，使研究者能夠更精確地定位染料的生物分布。離體三色成像為三色MSOT成像提供了額外的證據(jù)。重要的是，染料的低細(xì)胞毒性和體內(nèi)毒性分別通過細(xì)胞毒性研究和主要解剖器官切片的蘇木精和伊紅（H&E）染色得到驗(yàn)證。

 

這項(xiàng)研究揭示了一種有前景的解決方案，通過在七亞甲基菁的介觀位置引入包含三氟乙酰基單元和芐基單元的龐大支鏈結(jié)構(gòu)，確保J聚集體在NIR-II區(qū)域的吸收帶。通過對N-芐基部分的微小修飾，已經(jīng)獲得了一系列具有不同光譜性質(zhì)的J聚集體。已經(jīng)成功生長了九種單晶，對這些晶體學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，這表明，當(dāng)染料的單晶結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與J聚集一致的特征時(shí)，它可能具有形成J聚集體的內(nèi)在趨勢。此外，一系列 J 聚集體的可用性，其特點(diǎn)是具有有利的光譜特性，包括紅移和窄吸收/發(fā)射光譜以及增強(qiáng)的消光系數(shù)，能夠構(gòu)建用于多路復(fù)用三色 NIR-II 熒光和 MSOT 成像的最優(yōu)染料組合，在無串?dāng)_的成像中實(shí)現(xiàn)顯著的時(shí)空精度。這項(xiàng)研究為生成具有所需光譜特性的J聚集體提供了一種有效且直接的方法。

 

參考文獻(xiàn)

Zhang C, Wu Y, Zeng F, et al. Structurally Modulated Formation of Cyanine J‐Aggregates with Sharp and Tunable Spectra for Multiplexed Optoacoustic and Fluorescence Bioimaging[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(34): e202406694.

 

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