ELISA實驗原理操作詳細介紹和Protocol解決方案及其應用
01
酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)
酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)，一種廣泛用于基礎科學研究、臨床應用研究和診斷的免疫學檢測方法。
原理：
ELISA 技術依賴于抗原 (即靶蛋白) 與針對目標抗原的一抗之間的相互作用，通過酶聯(lián)抗體催化添加的底物來確認抗原的存在。
在 ELISA 中，將具有特定結合特性的液體樣品添加到反應室或微孔板內(nèi)的固定固相上。然后，依次孵育不同的液體試劑，從而在最終液體中產(chǎn)生一些光學變化 (例如，通過酶促反應產(chǎn)物的顏色變化)。其結果可以通過目視檢查定性檢測，也可以使用光度計或分光光度計的讀數(shù)定量檢測[1][2][3][4]。
本期我們介紹常見的三種 ELISA 類型：直接 ELISA (Direct ELISA)、間接 ELISA (Indirect ELISA) 和夾心 ELISA (Sandwich ELISA)。
圖 1. 常見的三種 ELISA 類型[1]。
a. 直接 ELISA 依賴于酶偶聯(lián)的一抗與抗原包被板的結合。b. 間接 ELISA 引入了對與抗原包被板結合的一抗具有特異性的酶聯(lián)二抗。c. 夾心 ELISA 技術包括將樣品抗原引入抗體預包被的板中，然后檢測和酶聯(lián)二抗依次結合到抗原上的識別位點。
02
ELISA 的實驗方案
ELISA 實驗通常分為幾個步驟：包被、封閉、孵育、檢測和結果分析。 SO，接下來小 M 為大家?guī)韺嶒灡貍涞?Protocol!
直接 ELISA
直接 ELISA 是檢測抗原的最簡單的方案。
將含有分析物的緩沖溶液加入 96 孔板中，讓其粘附在塑料板上一段時間 (圖 2a)。在直接 ELISA 中，加入帶有偶聯(lián)酶的一級檢測抗體，該抗體與覆蓋孔的抗原結合 (圖 2b)。將板孵育足夠長的時間以使抗原-抗體結合，并用磷酸鹽緩沖鹽水清洗以去除多余的抗體，然后加入酶的底物，在黑暗環(huán)境中等待酶-底物相互作用，然后用特定溶液停止反應。酶-底物相互作用導致顏色形成，可通過微孔板讀數(shù)器檢測到 (圖 2c)。分析時，將樣品讀數(shù)與標準曲線進行比較。
圖 2. 直接 ELISA 方案[3]。
基本操作：
一、包被：
(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 預設濃度的抗原，封板后于 4 °C 孵育過夜。
(2) 洗滌
使用 ELISA 洗板機，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。
二、封閉：
(3) 封閉
用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液以 100–200 μL/孔的量封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。
(4) 洗滌
按照步驟（2）進行洗滌。
三、孵育：
(5) 加入抗體偶聯(lián)物溶液
加入抗體偶聯(lián)物溶液 (Ab-HRP)，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復。封板后于室溫孵育 1 小時。
(6) 洗滌
去除溶液，并使用 ELISA 洗板機，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板六次。
(7) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達到所需的顏色強度 (標準品應出現(xiàn)明顯的梯度)。
(8) 終止反應
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液來終止反應。
四、檢測分析：
(9) 讀板
使用具有適當硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。
(10) 數(shù)據(jù)分析
間接 ELISA
在間接 ELISA 中，抗原固定 (圖 3a )、封閉和洗滌后，加入與抗原結合的一抗 (圖 3b)。將載體在封閉緩沖液中孵育，使封閉緩沖液稀釋的一抗結合到載體上，并用洗滌緩沖液洗滌，然后加入封閉緩沖液和帶有酶標的第二抗體 (圖 3c)。與直接 ELISA 類似，進行再次孵育、洗滌，加入底物，并使用微孔板讀數(shù)器掃描孔 (圖 3d)。
第二抗體也可以用熒光素標記，并使用熒光計在紫外光下對結果進行量化。這種方法稱為熒光聯(lián)免疫吸附試驗(Fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA)。
基本操作：
一、包被：
(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 預設濃度的抗原，封板后于 4 °C 孵育過夜。
(2) 洗滌
使用 ELISA 洗板機，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。
二、封閉：
(3) 封閉
用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液以 100–200 μL/孔的量封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。
(4) 洗滌
按照步驟（2）進行洗滌。
三、孵育：
(5) 加入一抗
加入一抗溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復。封板后于室溫孵育 1 小時。
(6) 洗滌
按照步驟（2）進行洗滌。
(7) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。
(8) 洗滌
去除溶液，并使用 ELISA 洗板機，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板六次。
(9) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達到所需的顏色強度 (標準品應出現(xiàn)明顯的梯度)。
(10) 終止反應
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液來終止反應。
四、檢測分析：
(11) 讀板
使用具有適當硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。
(12) 數(shù)據(jù)分析
應用：
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即時 HIV 檢測 (Point-of-care HIV testing)：測試棒上標有 HIV 抗原，血液樣本放在測試棒的末端。緩沖液允許任何抗體沿著棒子流動，并附著在抗原上。用抗人抗體 (二抗) 清洗，用偶聯(lián)酶標記，然后用染料清洗。顏色的變化代表積極的結果[3]。
夾心 ELISA
夾心ELISA 可分析更復雜的溶液。其名稱源于該裝置能夠將抗原“夾”在兩種抗體之間 (圖 4)。
將含有捕獲抗體的包被緩沖液加入孔板中并使其粘附 (圖 4a)。孵育后，清洗孔板并加入封閉緩沖液以封閉孔上任何剩余的結合位點。然后將樣品加入每個孔中并孵育特定時間 (圖 4b)。為確保結果的準確性，必須對每個孔板運行標準樣品 (陽性對照) 和空白樣品 (陰性對照)。然后將檢測抗體加入每個孔中 (圖 4c)，隨后加入偶聯(lián)的二抗和封閉緩沖液 (圖 4d)。在每個步驟之間，用磷酸鹽緩沖鹽水清洗孔。加入底物溶液并使用微孔板讀數(shù)器檢測結果 (圖 4e)。
基本操作：
一、包被：
(1) 包被捕獲抗體
向每孔加入 50–100 μL 預設濃度的捕獲抗體，封板后于 4 °C 孵育過夜或在室溫下孵育 2 小時。
(2) 洗滌
在 ELISA 洗板機中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。
二、封閉：
(3) 封閉
使用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液（100–200 μL/孔）封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。
(4) 洗滌
按照步驟 (2) 進行洗滌。
三、孵育：
(5) 加入標準品和樣品
向每孔加入 50–100 μL 標準品和樣品，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復。封板后于室溫孵育 2 小時。
(6) 洗滌
去除溶液，并在 ELISA 洗板機中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌六次。
(7) 加入一抗
加入另一種針對待測抗原不同表位的特異性檢測抗體，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，50–100 μL/孔，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。
(8) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，50–100 μL/孔，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。
(9) 洗滌
去除溶液，并在 ELISA 洗板機中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌六次。
(10) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達到所需的顏色強度 (標準品應出現(xiàn)明顯的梯度)。
(11) 終止反應
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液來終止反應。
四、檢測分析：
(12) 讀板
使用具有適當硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。
(13) 數(shù)據(jù)分析
分析數(shù)據(jù)。
應用：
- 家用妊娠試劑盒 (Point-of-care pregnancy testing): 使用夾心 ELISA 法快速提供與患者相關的結果。試紙條含有抗 β 人絨毛膜促性腺激素 (抗 βhCG) 和結合抗體，這些抗體與尿液樣本中的 βhCG 發(fā)生反應。用自來水沖洗試紙條以去除任何未結合的樣本，并與底物試劑一起孵育幾分鐘。顏色信號的存在和強度與樣本中的 βhCG 量成正比，可用于估計妊娠周齡。
03
如何做出更好的 ELISA 實驗？
想要做好一個 ELISA 實驗，確保結果的準確性和可靠性，除了基本的實驗步驟外，還需要注意一系列細節(jié)和考慮因素。 以下是小 M 為大家補充的一些 ELISA 實驗小細節(jié)：
But！勝敗乃兵家常事，實驗哪有不失敗的~各位 “科研汪”們，想找出實驗 Bug 的可能性原因？修復 Bug 還原“完美”數(shù)據(jù)？嘿嘿，戳下面~
表 2. 實驗失敗的可能性原因及解決方案[3]。
04
小結
本期小 M 為大家介紹了 ELISA 實驗的相關知識，從原理、類型、Protocol、應用blabla.....還有哪些實驗操作限制了你的課題進度？歡迎大家留言反饋給我們喔~
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產(chǎn)品推薦 |
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PBS Buffer (1x) (HY-K3005) PBS (1×) 磷酸鹽緩沖液是細胞培養(yǎng)最常用的緩沖液之一，可用于細胞清洗、細胞稀釋或其他常規(guī)用途。 |
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Tween 20 (HY-141415) Tween 20 (Polysorbate 20) 是一種聚氧乙烯 (POE) 型非離子表面活性劑。 |
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Goat Anti-Human IgG H&L (HRP) (HY-P83662) Goat Anti-Human IgG H&L (HRP) 是一種山羊來源的針對人 IgG 重鏈和輕鏈 (H&L) 的特異性抗體，偶聯(lián)了辣根過氧化物酶 (HRP) 作為報告基團，檢測靈敏度高，適用于 WB, IHC-P, ELISA 等各種實驗。 |
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TMB (HY-15930) TMB 是一種無毒且不致突變的無色染料，也是用于基于辣根過氧化物酶 (HRP) 的檢測系統(tǒng)的顯色劑。 |
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Bovine Serum Albumin (HY-D0842) Bovine Serum Albumin (BSA) 是由三個同源全 α 結構域組成的 583 個氨基酸的蛋白質(zhì)。BSA 是一種球狀蛋白，可用于多種生物化學實驗。 |
參考文獻：
[1] Konstantinou GN. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2017;1592:79-94.
[2] Hornbeck P, Winston SE, Fuller SA. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 11:Unit11.2.
[3] Tabatabaei MS, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2022;2508:115-134. doi: 10.1007/978-1-0716-2376-3_10. PMID: 35737237.
[4] Hayrapetyan H, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Types and Applications. Methods Mol Biol. 2023;2612:1-17.
