常見HLA匹配的七個(gè)SARS-CoV-2抗原免疫肽組分析詳解
大多數(shù) COVID-19 疫苗可針對 SARS-CoV-2 刺突蛋白產(chǎn)生免疫。然而，新出現(xiàn)的毒株中刺突蛋白的突變和 SARS-CoV-2 病毒的免疫逃避需要開發(fā)靶向范圍更廣的疫苗�；谶@個(gè)問題，8月30日，來自澳大利亞莫納什大學(xué)的Anthony W. Purcell教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表題為“Mapping the immunopeptidome of seven SARS-CoV-2 antigens across common HLA haplotypes”的相關(guān)研究成果。研究中使用質(zhì)譜法來鑒定源自七種相對保守的SARS-CoV-2蛋白（N、E、Nsp1/4/5/8/9）的免疫肽，數(shù)據(jù)分析使用PEAKS Online完成。
兩種實(shí)驗(yàn)方案鑒定SARS-CoV-2表位
用含有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以對成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行分類，從而有助于建立高純度的穩(wěn)定細(xì)胞系，通過擴(kuò)增收集大量細(xì)胞，便于建立免疫肽組學(xué)深度覆蓋數(shù)據(jù)，從而發(fā)現(xiàn)潛在的新生多肽。然而這種方法耗時(shí)長達(dá)2個(gè)月，且細(xì)胞培養(yǎng)工作繁瑣。因此，作者又嘗試了一種將SARS-CoV-2蛋白直接遞送到細(xì)胞中的替代方法（圖1）。電穿孔法將純化重組病毒或其他蛋白質(zhì)遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，再到收集細(xì)胞的過程僅需48小時(shí)。如果這種電轉(zhuǎn)染方法可以使目標(biāo)抗原蛋白成功導(dǎo)入抗原加工通路中，那么在發(fā)現(xiàn)新病原體及變異蛋白時(shí)，將極大地縮短表位發(fā)現(xiàn)和疫苗開發(fā)的周期。
兩種實(shí)驗(yàn)方案鑒定SARS-CoV-2表位
圖1 SARS-CoV-2表位鑒定的兩種實(shí)驗(yàn)方案
SARS-CoV-2基因轉(zhuǎn)染的BLCL呈遞的HLA多肽鑒定結(jié)果
作者基于質(zhì)譜法分別對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的9004和9087 BLCL 細(xì)胞系中，病毒E、N、Nsp8和Nsp9蛋白的HLA結(jié)合表位進(jìn)行鑒定，數(shù)據(jù)分析使用PEAKS Online完成。平均鑒定出HLA-I類肽34164條，HLA-II類肽76863條（圖2A），總共鑒定超過500,000條人類多肽序列，其中包括181條非冗余SARS-CoV-2多肽。
HLA-I類肽長度主要為9 mer，HLA-II類肽則主要分布在12-18 mer，符合預(yù)期（圖2B）。值得注意的是，對于9087 BLCL，HLA I 類數(shù)據(jù)集中檢測到了相對較多的長度為8氨基酸的多肽，且大多數(shù)均歸屬于HLA-B*08:01。據(jù)先前研究報(bào)道，HLA-B*08:01結(jié)合的8肽數(shù)量與9肽數(shù)量之比僅為0.4倍，而在本數(shù)據(jù)集中為0.8倍[1,2]。此外，單電荷母離子對于檢測較短肽段尤為重要。因此，作者分析了數(shù)據(jù)集中8肽的電荷狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)8肽母離子為單電荷，而9肽通常帶雙電荷，此信息未曾有研究報(bào)道。然后，作者進(jìn)行了基序分析，結(jié)果顯示主要結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞系中表達(dá)的HLA-I同種異型的預(yù)期結(jié)合基序一致（圖 2C）。因此，該數(shù)據(jù)集不僅鑒定到了大量新的SARS-CoV-2免疫肽，而且可作為BLCL的擴(kuò)展人類免疫肽組研究數(shù)據(jù)庫，特別是針對HLA-B*08:01同種異型的8肽。
HLA-I類肽長度主要為9 mer，HLA-II類肽則主要分布在12-18 mer，符合預(yù)期（圖2B）。值得注意的是，對于9087 BLCL，HLA I 類數(shù)據(jù)集中檢測到了相對較多的長度為8氨基酸的多肽，且大多數(shù)均歸屬于HLA-B*08:01。據(jù)先前研究報(bào)道，HLA-B*08:01結(jié)合的8肽數(shù)量與9肽數(shù)量之比僅為0.4倍，而在本數(shù)據(jù)集中為0.8倍[1,2]。此外，單電荷母離子對于檢測較短肽段尤為重要。因此，作者分析了數(shù)據(jù)集中8肽的電荷狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)8肽母離子為單電荷，而9肽通常帶雙電荷，此信息未曾有研究報(bào)道。然后，作者進(jìn)行了基序分析，結(jié)果顯示主要結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞系中表達(dá)的HLA-I同種異型的預(yù)期結(jié)合基序一致（圖 2C）。因此，該數(shù)據(jù)集不僅鑒定到了大量新的SARS-CoV-2免疫肽，而且可作為BLCL的擴(kuò)展人類免疫肽組研究數(shù)據(jù)庫，特別是針對HLA-B*08:01同種異型的8肽。
圖2 病毒基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的BLCL抗原肽呈遞結(jié)果
電穿孔直接遞送SARS-CoV-2蛋白的BLCL HLA多肽鑒定
作為基因轉(zhuǎn)染法的替代方案，作者通過電穿孔法分別將SARS-CoV-2的Nsp1/4/5/9和N蛋白直接遞送到BLCL細(xì)胞中。HLA I類平均鑒定出10,578個(gè)長度為8-12的多肽，HLA II類平均鑒定出22,044個(gè)長度為10-20的多肽（圖 3A）。由于直接遞送蛋白使用的細(xì)胞量偏低，因此比基因轉(zhuǎn)染法檢出量少，但肽段長度分布趨勢相同（圖 3B）。并且9004 BLCL洗脫肽的motif與基因轉(zhuǎn)染法相似（圖 3C）。作者通過蛋白直接遞送的方法共檢測到了81種特異的SARS-CoV-2 HLA I類和II類多肽。在陰性對照的親本細(xì)胞系中，未檢測到任何病毒相關(guān)多肽。
圖3 直接蛋白遞送法鑒定的免疫肽
蛋白直接遞送法與基因轉(zhuǎn)染法結(jié)果對比
對于N蛋白，在基因轉(zhuǎn)染的9004和9087 BLCL中分別鑒定到32和33條HLA肽（包含I型和II型）。蛋白直接遞送的9004 BLCL中則沒有鑒定到N蛋白衍生肽，在9087 BLCL中僅鑒定到10條HLA II型多肽。此差異可能是由于病毒的核殼蛋白衍生多肽更加傾向于以HLA II類分子呈遞。兩種方法之間Nsp9蛋白衍生多肽的呈遞相似度更高，均鑒定到了具有相同9-mer核心的多肽，此外一些肽僅在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測到，一些HLA II類多肽僅在蛋白直接遞送方法鑒定（圖 4A）。因此可以看出，直接遞送方法中外源性蛋白的引入主要參與HLA II類多肽的呈遞過程，而基因轉(zhuǎn)染方法則會更全面地覆蓋I型和II型多肽呈遞過程。針對研發(fā)時(shí)間緊迫的HLA II類抗原，可考慮使用蛋白直接遞送的方法，但如果蛋白來源是細(xì)菌，則無法涵蓋哺乳動(dòng)物的翻譯后修飾信息�；蜣D(zhuǎn)染方法雖然耗時(shí)長且勞動(dòng)強(qiáng)度較大，但可提供來自目標(biāo)基因的更完整的HLA I類和II類抗原信息，在新抗原的發(fā)現(xiàn)研究中仍是無法被完全替代的。
圖4 SARS-CoV-2 衍生蛋白的HLA-I和HLA-II多肽分布
病毒抗原呈遞的免疫肽組學(xué)
將鑒定到的病毒HLA肽與SARS-CoVI-2源蛋白序列比對，作者發(fā)現(xiàn)了在不同HLA分型和細(xì)胞系中高頻出現(xiàn)的12個(gè)熱點(diǎn)呈遞抗原（圖4B）。此外在疫苗設(shè)計(jì)時(shí)，需要盡可能排除致病抗原與人類蛋白質(zhì)的任何潛在交叉反應(yīng)，以避免出現(xiàn)自身免疫等不良影響。因此作者分析了鑒定到的HLA多肽與人類基因組的相似性，每條多肽最多允許2個(gè)氨基酸不一致，不考慮插入和缺失，最終篩選出43條與人源蛋白高度相似的肽段。
病毒多肽的翻譯后修飾
在所有鑒定到的248條非冗余病毒多肽中，54條是帶有修飾基團(tuán)的（表1），并且氧化（M）、脫酰胺（Q,N）、脫水、乙酰化、半胱氨酸化等與已報(bào)道的HLA肽常見修飾一致[3-6]。其中，Nsp9: 32YYN(+0.98)TTKGGRF41和Nucleoprotein: 267AYN(+0.98)VTQAF276值得關(guān)注，因?yàn)樗鼈兙诨蜣D(zhuǎn)染的9004 BLCL的HLA-I類樣品中被鑒定到，并且都有NX(S/T)基序。據(jù)報(bào)道，SARS-CoV-2核衣殼蛋白的N269位置有高達(dá)94%都是被糖基化修飾的[7]，此處的脫酰胺應(yīng)該是由N糖鏈被切除產(chǎn)生的。
表1 HLA多肽的翻譯后修飾匯總
與IEDB中HLA多肽的相關(guān)性分析
作者對比了IEDB中質(zhì)譜法鑒定的378條SARS-CoV-2相關(guān)多肽，結(jié)果顯示本研究很大程度上增加了HLA-B*08:01/B*27:05、HLA-C*01:02/C*07:01、HLA-DQA*05:01/DQB1*02:01和HLA-DRA1*01/HLA-DRB1*01:01/DRB1*03:01結(jié)合的多肽數(shù)量，并增加了兩種高度流行的HLA分型A*01:01/A*01:02的結(jié)合肽數(shù)量（圖5）。
圖5 本研究結(jié)果與IEDB數(shù)據(jù)庫對比
部分SARS-CoV-2多肽的免疫原性驗(yàn)證
作者選取了56條SARS-CoV-2的多肽（均不含反應(yīng)性半胱氨酸）進(jìn)行合成，并將其分為3組，對9名SARS-CoV-2患者的PBMC進(jìn)行 T細(xì)胞活化測定，這些患者的HLA表型均與BLCL匹配。每個(gè)患者的PBMC經(jīng)三組多肽分別刺激并擴(kuò)增10天，然后測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（圖 6A）。對于在第 10 天對某組肽段反應(yīng)明顯的細(xì)胞，在第 13 天用該組中的部分肽段再次刺激（圖 6B-D）。值得注意的是，在感染癥狀出現(xiàn)后72天收集的患者PBMC樣品中，檢測到了對源自 E、Nsp1 和 Nsp9 蛋白的特征多肽的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)（圖6B）。
進(jìn)一步檢測到三個(gè)患者的樣品對19肽N 343-361 ( DPNFKDQVILLNKHIDAYK ) 有顯著反應(yīng)，而具有共享氨基酸片段的 N 333-349 (YTGAIKLDDKDPNFKDQ )抗原特異性反應(yīng)不明顯 (圖6C)�；颊�1、8、9的PBMC分別為感染癥狀出現(xiàn)后的第 109、210 和 12 天收集。患者1和8均未接種疫苗，患者9為接種疫苗后的突破性感染。以上結(jié)果表明，COVID-19 患者在感染后7個(gè)月內(nèi)對SARS-CoV-2 N蛋白擁有持續(xù)的特異性CD4+T細(xì)胞免疫力。
此外，還檢測到一名患者對pool 3肽段的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，其PBMC采集時(shí)間為癥狀出現(xiàn)后 214 天（圖6D）。然后，進(jìn)一步對pool 3肽段分組測試，將反應(yīng)范圍縮小到3B組（N 71-85（GVPINTNSSPDDQIG）、N77-86（NSSPDDQIGY）和N77-87（NSSPDDQIGYY）），N77-86和N 77-87均預(yù)測可與HLA-A*01:01結(jié)合。
圖6 SARS-CoV-2部分多肽的T細(xì)胞反應(yīng)活性測定
小結(jié)
本研究通過基因轉(zhuǎn)染和蛋白直接導(dǎo)入的方式，很大程度上提高了SARS-CoV-2七種常見非結(jié)構(gòu)蛋白衍生免疫肽的質(zhì)譜鑒定深度，同時(shí)也為特異性T細(xì)胞反應(yīng)提供了重要實(shí)驗(yàn)證據(jù)。有助于深入了解SARS-CoV-2易于呈遞的抗原肽，便于合理設(shè)計(jì)下一代 COVID-19 疫苗，以應(yīng)對一系列新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變體。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-51959-6
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參考文獻(xiàn)
1. Gfeller, D. et al. The length distribution and multiple specificity of naturally presented HLA-I ligands. J. Immunol. 201, 3705–3716 (2018).
2. Sarkizova, S. et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nat. Biotechnol. 38, 199–209 (2020).
3. Ramarathinam, S. H., Ho, B. K., Dudek, N. L. & Purcell, A. W. HLA class II immunopeptidomics reveals that co-inherited HLA-allotypes within an extended haplotype can improve proteome coverage for immunosurveillance. Proteomics 21, e2000160 (2021).
4. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
5. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
6. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
7. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
本研究通過基因轉(zhuǎn)染和蛋白直接導(dǎo)入的方式，很大程度上提高了SARS-CoV-2七種常見非結(jié)構(gòu)蛋白衍生免疫肽的質(zhì)譜鑒定深度，同時(shí)也為特異性T細(xì)胞反應(yīng)提供了重要實(shí)驗(yàn)證據(jù)。有助于深入了解SARS-CoV-2易于呈遞的抗原肽，便于合理設(shè)計(jì)下一代 COVID-19 疫苗，以應(yīng)對一系列新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變體。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-51959-6
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參考文獻(xiàn)
1. Gfeller, D. et al. The length distribution and multiple specificity of naturally presented HLA-I ligands. J. Immunol. 201, 3705–3716 (2018).
2. Sarkizova, S. et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nat. Biotechnol. 38, 199–209 (2020).
3. Ramarathinam, S. H., Ho, B. K., Dudek, N. L. & Purcell, A. W. HLA class II immunopeptidomics reveals that co-inherited HLA-allotypes within an extended haplotype can improve proteome coverage for immunosurveillance. Proteomics 21, e2000160 (2021).
4. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
5. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
6. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
7. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
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