活細胞無時不在與外界進行著物質(zhì)和能量的交換，其代謝水平應(yīng)是其生命體征的主要表現(xiàn)。在健康和疾病中，代謝程序和它們所支持的特定生理功能之間有著密切的聯(lián)系。這些核心代謝功能的失調(diào)與許多現(xiàn)代疾病有關(guān)。由于每個細胞都生活在一個獨特的環(huán)境中，我們體內(nèi)沒有一個細胞在新陳代謝、表型和功能上完全相同。在單細胞分辨率下，解決代謝的時空異質(zhì)性將推動代謝領(lǐng)域向前發(fā)展，并轉(zhuǎn)換到臨床應(yīng)用和理解體內(nèi)系統(tǒng)代謝組學(xué)變化的基礎(chǔ)。

相比DNA和RNA，細胞內(nèi)的代謝物無法擴增，單個細胞能夠提供的用于分析的代謝物濃度低體積小，對分析設(shè)備和方法的要求較高。因此，本次研究將具有單細胞取樣精度的激光顯微切割 (LMD, Laser Microdissection)技術(shù)和SCIEX 7500高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)合使用，測試在能夠用于有效分析的細胞數(shù)量。
 

實驗設(shè)計

樣品制備：

腦組織做冰凍切片，樣本置于激光顯微切割載物臺；接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適的細胞數(shù)目或切割面積（如~2000μm²），在調(diào)節(jié)好相關(guān)參數(shù)（Power 49、Aperture 5、Speed 13、Bridge size 4）后開始進行切割（圖1）。切割完成后，小心將PCR管取出，由管底倒扣至管蓋蓋緊，防止管蓋中收集的樣品遺落。

圖1. 腦組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。在40倍放大視野中選取合適的面積，約2000 μm2（左）進行切割分離并用于后續(xù)分析；一份樣品切割分離完成后（右），可繼續(xù)選擇其他區(qū)域進行操作。

樣品提取：

裝有樣品的PCR管在vortex中振蕩5s，由點甩小型離心機將微量樣品離心至管底，小心打開管蓋，加入30 μL提取溶液（異丙醇:乙腈:水 30:65:5 v/v/v），振蕩混勻，超聲15 min，離心后將全部溶液轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中待LC-MS/MS分析。LC-MS條件：樣品通過ExionLC^™系統(tǒng)串聯(lián)SCIEX 7500系統(tǒng)，進行分析。數(shù)據(jù)通過SCIEX OS 軟件2.1中的定量功能進行處理。

分析結(jié)果

在分離的微量細胞中（組織切片約2000μm²），共檢測到285個脂質(zhì)化合物，包括鞘脂SM、膽固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰膽堿PC、神經(jīng)酰胺Cer7類。

圖2.微量腦組織切片中測得的不同種類脂質(zhì)化合物的數(shù)量�；�于LC-MS/MS 的靶向脂質(zhì)組學(xué)方法快速分析基質(zhì)中的多種脂類物質(zhì)。

圖3.對于微量細胞中檢測到的脂質(zhì)化合物的判定，主要基于與空白提取溶劑（陰性對照）和血漿脂質(zhì)提取樣本（陽性對照）共同比較，并且結(jié)合各類脂質(zhì)標準品出峰位置情況、同類脂質(zhì)化合物有較為接近的出峰位置，而同類脂質(zhì)化合物連接脂肪酸鏈越長保留時間越靠后、連接相同碳數(shù)的脂肪酸鏈上不飽和鍵數(shù)越多保留時間越靠前的規(guī)律，對微量樣本中檢出的脂質(zhì)化合物做定性判斷。

通過徠卡激光切割顯微鏡LMD7獲取微量樣本技術(shù)與SCIEX 7500 系統(tǒng)高靈敏度檢測相結(jié)合，實現(xiàn)微量細胞高覆蓋靶向脂質(zhì)組學(xué) PE（P-18:0_18:0）分析檢測。在約2000μm² 組織切片樣品中檢測到脂質(zhì)化合物數(shù)目285個，符合組學(xué)分析對化合物覆蓋度的需求。

相關(guān)產(chǎn)品

Leica LMD6 & LMD7激光顯微切割系統(tǒng)

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