脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)已被廣泛應(yīng)用于遞送siRNA和mRNA等核酸藥物，其不僅保護(hù)RNA不被降解，并且促進(jìn)了核酸向靶細(xì)胞和組織的遞送。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)LNP中脂質(zhì)分子和核酸的組裝模式顯著影響著下游的生物學(xué)性能，如細(xì)胞毒性、血液循環(huán)時(shí)間和負(fù)載RNA活性等。近期有研究報(bào)道通過調(diào)控LNP的脂質(zhì)組成所形成的反六邊形結(jié)構(gòu)可有效提高siRNA在細(xì)胞內(nèi)的基因沉默效率。因此，LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析對(duì)于核酸裝載LNPs的研發(fā)和質(zhì)量控制至關(guān)重要。目前，小角度X射線散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)和小角度中子散射(small-angle neutron scattering, SANS）是對(duì)LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)定位分析最常用的技術(shù)手段，但以上兩種方法嚴(yán)重依賴于特定大型儀器設(shè)備。因此，亟需開發(fā)一種通用性強(qiáng)的分析方法以評(píng)估LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分子組成。

近日，來自日本千葉大學(xué)的Keisuke Ueda團(tuán)隊(duì)在Journal of Controlled Release上發(fā)表了研究論文“NMR-based analysis of impact of siRNA mixing conditions on internal structure of siRNA-loaded LNP”。該文章利用溶液態(tài)¹H NMR探討了不同制備方法所得siRNA LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，并聯(lián)合NMR、NanoFCM、SAXS和Cryo-TEM等多項(xiàng)技術(shù)探究了不同siRNA混合條件對(duì)所得siRNA LNP的分子組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。

01 siRNA-LNPs的制備工藝
如圖1所示，作者選取4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯(DLin-MC3-DMA, MC3)為可電離脂質(zhì)，并參考已商品化的LNP合成配方(MC3：DSPC：cholesterol：DMG-PEG = 50:10:38.5:1.5)，使用三種不同制備方法，以考察不同siRNA混合條件對(duì)siRNA-LNPs組裝的影響。

01 預(yù)混合法
使用微流控混合器將含有siRNA的酸性溶液與脂質(zhì)的乙醇溶液預(yù)先混合，隨后使用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4)進(jìn)行透析，制備siRNA LNPs。

02 后混合法(A)
在與預(yù)混合法相同的條件下，使用iLiNP裝置將脂質(zhì)溶液和不含siRNA的醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)混合，先制備得到空載的LNP；隨后，將siRNA儲(chǔ)存液加入到酸性的空LNP中，倒置混合后，用PBS(pH 7.4)透析所得混合物，制備混合后的LNP(A)。

03 后混合法(B)
用上述相同方法制備空LNP后，用醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)對(duì)其進(jìn)行透析，隨后將siRNA 儲(chǔ)存液加入其中，倒置混合后用PBS(pH 7.4)透析，制備混合后的LNP(B)。
 

圖1. siRNA LNPs的制備方法示意圖

02 不同混合條件下siRNA-LNPs理化性質(zhì)
DLS和Cyro-TEM結(jié)果顯示裝載有siRNA的LNP粒徑較空LNP略大，且后混合法比預(yù)混合法得到的siRNA-LNPs粒徑更大，并伴隨著70 nm以上顆粒數(shù)量的增加。推測這一現(xiàn)象是由于在混合初期形成了粒徑較大的LNP前驅(qū)體。Cryo-TEM成像下，空載LNP和siRNA LNPs形態(tài)無顯著差別，即通過形態(tài)無法判斷LNPs是否成功裝載了siRNA分子。此外，RiboGreen核酸定量法顯示三種制備方法所得LNPs的核酸包封率均超過95%，且無顯著差別。

作者進(jìn)一步使用NanoFCM在單LNP水平對(duì)siRNA的裝載情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示三種方法制備的siRNA LNPs中空載LNP的比例均低于3.5%，且顆粒粒徑大小（散射）與核酸裝載量（熒光）呈正相關(guān)（圖2a）。此外，在預(yù)混合法制備的LNPs中，大部分顆粒都位于紅色虛線所劃分的區(qū)域，即相似大小的LNP顆粒之間的siRNA負(fù)載變化較小，而后混合法制備的LNPs顯示出更寬的粒徑范圍以及更強(qiáng)的熒光信號(hào)，即后混合法在提高LNP粒徑的同時(shí)可提高單個(gè)LNP上siRNA的裝載量。同時(shí)，SAXS測量結(jié)果顯示，預(yù)混合和后混合的LNPs均形成了siRNA-MC3堆疊雙層結(jié)構(gòu)(圖2b)。
 

圖2. 不同方法制備的siRNA封裝效率(a)和SAXS圖譜(b)

03 混合條件對(duì)siRNA LNP組裝結(jié)構(gòu)的影響
如圖3所示，NMR在分子水平表征進(jìn)一步揭示了不同混合條件所得siRNA LNPs的組裝差異。在預(yù)混合法所得LNPs中，由于siRNA和MC3之間的相互作用使其在整個(gè)LNP中均勻分布。而后混合法所得LNPs則存在siRNA富集和空siRNA的區(qū)域。這可能是由于在混合過程中，帶正電荷的囊泡在局部高siRNA濃度的區(qū)域與之形成復(fù)合物，從而形成siRNA富集區(qū)域。而另外一些帶正電荷的囊泡沒有與siRNA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致空siRNA區(qū)域的出現(xiàn)。此外，后混合法LNP(B)中siRNA富集和空siRNA區(qū)域比后混合法LNP(A)更明顯，可能是由于早期乙醇的存在促進(jìn)siRNA-MC3堆疊雙層結(jié)構(gòu)的均勻混合和形成。
 

圖3. 不同混合條件得到的siRNA-LNP示意圖

結(jié)合下游細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)siRNA在LNPs中分布的均勻性會(huì)顯著影響siRNA的沉默效率。基于NMR對(duì)siRNA LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)的表征，可揭示siRNA LNP的分子水平異質(zhì)性，對(duì)于優(yōu)化siRNA LNP制劑的制備條件具有重要意義。

展望
隨著疫情的結(jié)束，RNA療法研究方向轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼜V泛的治療性疫苗或藥物。不管是藥物的包封工藝開發(fā)、分析方法開發(fā)還是終產(chǎn)品的質(zhì)控，都需要全面了解核酸藥物的性質(zhì)。工欲善其事必先利其器，NanoFCM開創(chuàng)性地提出了一種高靈敏、快速、直接、無損的核酸藥物解決方案，適用于siRNA LNP、mRNA LNP等多種核酸藥物的綜合表征，為mRNA疫苗等核酸納米藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制提供了重要的技術(shù)保障，這將極大加快核酸療法的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。
 

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