脂質(zhì)納米藥物歷經(jīng)幾十年的積累和沉淀，終于迎來了爆炸式的增長，目前已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤研究和治療中。隨著研究的進(jìn)一步開展，使用脂質(zhì)納米藥物進(jìn)行靶向給藥的概念也越來越深入人心。通過在脂質(zhì)納米藥物表面修飾與靶細(xì)胞受體特異性結(jié)合的配體以改變藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)特性，是實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)靶向遞送的重要手段，該方法也被稱為主動(dòng)靶向，被認(rèn)為是進(jìn)一步提高納米藥物治療效果的最佳策略之一。目前，該策略已被用于包括脂質(zhì)體(liposomes)、脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)、細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在內(nèi)的多種藥物遞送載體表面功能化修飾。

然而，精確和可控地調(diào)節(jié)表面配體的呈遞（如配體密度、分布、取向和構(gòu)象等）仍然是靶向脂質(zhì)納米顆粒面臨的主要挑戰(zhàn)。如果靶向配體密度太高，當(dāng)靶向受體在其它組織中低表達(dá)時(shí)，納米顆粒將產(chǎn)生“脫靶效應(yīng)”；更糟糕的是，由于空間位阻的存在，配體與受體結(jié)合會(huì)有障礙。如果配體密度太低，細(xì)胞攝取和內(nèi)化效率就會(huì)受到影響。一般來說，靶向配體的最佳密度應(yīng)與受體在靶細(xì)胞表面的分布相匹配。受體識(shí)別和靶點(diǎn)遞送的關(guān)鍵是靶向脂質(zhì)納米顆粒外表面靶向配體的密度和分布，以及靶向生物大分子（如蛋白質(zhì)、抗體和適配體等）的構(gòu)象。活性靶向配體的批間一致性對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)至關(guān)重要，這一點(diǎn)也與表面靶向配體的表征高度相關(guān)。

01 靶向配體表征方法
批量測定方法
高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）常用于分析靶向配體的組成，但是它無法區(qū)分配體是朝向脂質(zhì)納米顆粒的內(nèi)腔還是外表面。通過直接定量分析和間接表征分析的方法可以判斷配體的活性情況。直接定量分析基于靶向配體可以與特定的指示劑反應(yīng)，這些生化分析可用于定量檢測脂質(zhì)納米顆粒中有活性的靶向配體的密度。如抗體或者蛋白可以借助免疫熒光或免疫化學(xué)探針滴定，通過蛋白質(zhì)分析BCA試劑盒和凝膠電泳等方法來定量；此外，利用擴(kuò)增DNA序列和凝膠電泳可以檢測核酸適配體；而肽則可以通過與伯胺反應(yīng)獲得的熒光胺進(jìn)行分析。間接的表征分析則是在插入（靶向配體）后，從總加料反應(yīng)物中減去游離的未偶聯(lián)的配體或功能性基團(tuán)的量等于偶聯(lián)成功的數(shù)量。當(dāng)然，也可以使用熒光探針預(yù)標(biāo)記靶向配體，但預(yù)標(biāo)記的靶向配體與未處理的配體相比可能具有不同的性質(zhì)或反應(yīng)活性，導(dǎo)致偶聯(lián)效率的差異，這種結(jié)果往往無法反應(yīng)靶向脂質(zhì)納米顆粒的真實(shí)情況。以上方法從群體水平對(duì)于配體組成進(jìn)行分析，而脂質(zhì)納米藥物制劑異質(zhì)性強(qiáng)且具有多分散特性，因此在單顆粒水平上量化配體密度至關(guān)重要。

單顆粒表征方法
I)中國學(xué)者基于納米流式檢測技術(shù)及定量流式分析方法建立了一種單脂質(zhì)體顆粒配體靶向修飾和密度定量表征策略，并據(jù)此揭示脂質(zhì)體制備方法、配體投入量及表面聚合物修飾等多種參數(shù)對(duì)配體密度分布及其異質(zhì)性的影響。該方法廣泛適用于檢測各種配體類型的靶向脂質(zhì)納米顆粒的活性配體密度，只要熒光標(biāo)記的重組受體可以被工程化。（詳見往期文章：一文讀懂|脂質(zhì)納米藥物靶向修飾研究新進(jìn)展）
 

圖1. 脂質(zhì)體表面配體密度定量

II)丹麥科技大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)在熒光顯微鏡平臺(tái)上開發(fā)了一種單顆粒水平直接分析表面抗體密度的方法。簡單來說，將DiD熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體通過生物素/鏈霉親和素蛋白接頭固定在玻片上，與血漿一起孵育，血漿中的調(diào)理素會(huì)與脂質(zhì)體發(fā)生相互作用，隨后用熒光標(biāo)記(AF488)的一抗測量特定調(diào)理素(如IgM)的結(jié)合情況。他們的研究結(jié)果表明，抗體和抗原的調(diào)理作用高度取決于納米藥物的表面化學(xué)性質(zhì)，包括PEG修飾。
 

圖2. 成像法分析脂質(zhì)體表面配體示意圖

對(duì)此，有學(xué)者這樣評(píng)價(jià)：這些單顆粒測定提供了現(xiàn)有批量測定方法無法獲得的細(xì)節(jié)信息，并為高質(zhì)量靶向脂質(zhì)納米顆粒的開發(fā)提供指導(dǎo)。當(dāng)然，在評(píng)估靶向修飾的維度時(shí)，除了修飾效率（陽性率）和單個(gè)顆粒上的拷貝數(shù)（密度）等指標(biāo)，還應(yīng)關(guān)注修飾前后納米藥物的物理性質(zhì)（如粒徑分布，單分散性，zeta電位等）是否發(fā)生顯著變化；其次，修飾后的樣品穩(wěn)定性是否發(fā)生改變，比如是否容易導(dǎo)致團(tuán)聚、批間一致性等問題均需要重點(diǎn)跟蹤。

基于當(dāng)前表征配體修飾的必要性和挑戰(zhàn)性，NanoFCM隆重推出了完整的靶向配體修飾檢測方案，一次檢測滿足以上多重需求。

02 NanoFCM配體檢測方案
NanoFCM基于瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)，可快速獲得粒徑、濃度和熒光標(biāo)記的生化指標(biāo)信息，基于強(qiáng)大的軟件數(shù)據(jù)分析功能，在此基礎(chǔ)上獲得顆粒表面積和顆粒配體數(shù)量，從而確定每100nm²LNP的配體密度。

靶向配體修飾分析
配體修飾后的LNP樣品以合適比例與AF488熒光抗體充分混勻并孵育，去游離抗體后采用NanoFCM分析，獲得散射強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度二維散點(diǎn)圖（圖3），獲得成功修飾配體的群體（P1）和未修飾配體群體（P2）。
 

圖3. 靶向配體修飾效率

熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線
配置一系列濃度梯度的熒光定量微球，采用 NanoFCM分析，獲得熒光強(qiáng)度與ERF工作曲線（圖4）。
 

圖4. 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

待測LNP樣品粒徑和熒光強(qiáng)度分析
配體修飾后的LNP樣品以合適比例與AF488熒光抗體充分混勻并孵育，去游離抗體后采用NanoFCM分析，獲得Size（粒徑）與Concentration（濃度）以及Size與熒光強(qiáng)度二維散點(diǎn)圖。結(jié)果顯示，有74.3%的顆粒成功修飾了配體，該群體粒徑為98.7±19.2nm，濃度為2.37E+9 particles/mL。
 

圖5. LNP樣品多參數(shù)表征

LNP配體密度分析
根據(jù)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可快速獲知待測單個(gè)LNP顆粒熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的ERF數(shù)值，基于AF488與抗體特定的結(jié)合比例，獲得單顆粒配體數(shù)量信息。同時(shí)，軟件可結(jié)合顆粒粒徑結(jié)果，直接獲得顆粒表面積(nm²)，從而獲得每100nm²配體拷貝數(shù)信息，該結(jié)果可進(jìn)一步指導(dǎo)配體修飾條件優(yōu)化。
 

圖6. NanoFCM配體密度結(jié)果

展望

福流生物緊跟行業(yè)發(fā)展步伐和客戶表征需求，結(jié)合新上市的熒光定量微球產(chǎn)品和強(qiáng)大的Flare軟件分析功能，相比于傳統(tǒng)配體密度檢測的方法，NanoFCM提供了單顆粒水平的分析視角，快速獲得LNP樣品的粒徑及分布、濃度、空殼率、包封率及每100nm²配體拷貝數(shù)等信息。此外，NanoFCM還可用于特異性抗體篩選，制備條件優(yōu)化等環(huán)節(jié)。不論是脂質(zhì)體、LNP還是EVs，NanoFCM對(duì)多種主動(dòng)靶向的納米載體均具有普適性。歡迎聯(lián)系我們獲取方案。