司美格魯肽獲批上市，全球刮起“肽肽風”。  你知道嗎？“肽肽”們也有幫派: 線性肽和環(huán)狀肽。  更高的靶點親和力、更好的代謝穩(wěn)定性、更佳的生物膜透性……本期小 M 為大家介紹“好肽肽”環(huán)狀肽聯(lián)合 DEL 篩選如何破局 Mcl-1 成藥難問題？  

01
環(huán)肽：破局難成藥蛋白！
 
逃避細胞凋亡對腫瘤的發(fā)展和生長至關(guān)重要，Mcl-1  (Myeloid cell leukemia 1) 是 Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) 蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白之一，對腫瘤的生存起到關(guān)鍵的保護作用。開發(fā) Mcl-1 抑制劑意味著需要阻斷蛋白-蛋白相互作用，通常需要對結(jié)構(gòu)更復雜更大的分子進行漫長的優(yōu)化。

近日，荷蘭的 Symeres 制藥公司在藥物化學 TOP 期刊 JMC 上介紹了通過 DEL 篩選發(fā)現(xiàn)新型 Mcl-1 抑制劑的全過程，小 M 將基于此研究跟大家分享該藥物分子的開發(fā)過程。

圖 1. 新型 Mcl-1 抑制劑的開發(fā)過程^[1]。

文獻要點：

• Mcl-1 的抑制需要阻斷蛋白-蛋白相互作用，這通常需要相對比較大，結(jié)構(gòu)復雜的(半) 肽類化合物來實現(xiàn)。

• 使用 DNA 編碼環(huán)肽庫和 DEL 篩選來直接篩選結(jié)構(gòu)復雜的大環(huán)化合物得到 3 個苗頭分子，但是溶解性和透膜性差，以及活性需要進一步的提升。

• 通過配體-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析確認苗頭分子 cpd3 的構(gòu)象。基于口袋分析，認為 P1’口袋可以進一步誘導，以此為重點改構(gòu)方向提升分子活性以及優(yōu)化分子的理化性質(zhì)。

• 保持大環(huán)骨架不變，針對性的對 P1’口袋處的側(cè)鏈進行優(yōu)化。引入苯環(huán)進一步占據(jù) P1’口袋，活性可以提升 100 倍，苯環(huán)上再引入柔性基團可以提升透膜性，引入雜原子或者新的基團降低 LogD，可以提高溶解性，最終得到 2 個先導化合物 57/59，適合未來進一步的開發(fā)用于疾病的治療。
   

02
DEL 篩選：發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的苗頭分子

在過去的 5-10 年里，文獻 (專利) 中披露了一系列有潛力的 Mcl-1 選擇性抑制劑，其中一些化合物已推入臨床，但結(jié)果不是很理想，并且存在某些毒性問題。鑒于抑制 Mcl-1 的功能需要破壞蛋白-蛋白相互作用，大多數(shù) Mcl-1 抑制劑的部分理化性質(zhì)不符合 Lipinski 類藥五原則，如 LogP, PSA 和 MW 等。

圖 2 展示了過去十年報道的代表性的選擇抑制劑，這些化合物都是從較小的非環(huán)分子演化來的，在先導物的發(fā)現(xiàn)和改構(gòu)過程中存在著許多明顯的挑戰(zhàn)，而通過高通量篩選識別到有活性的大環(huán)分子需要異常龐大和多樣化的化合物庫，這通常只有 DNA 編碼化合物庫 (DEL) 才能做到。

圖 2. 不同類型的 Mcl-1 抑制劑結(jié)構(gòu)^[1]。

 
DEL 篩選這么牛，研究人員是怎么做到的呢？

▐  第一步：DEL 建庫。

該 DNA kit 由 21 種 DEL Library 混和而成，每個 Library 由一套獨特的 DNA 兼容反應和一系列的分子砌塊構(gòu)建而成，庫中每個分子以共價鍵的形式連接了一段記錄其分離與合并過程并允許其識別的唯一的 DNA 序列。其中 1 個 Library 為一個環(huán)肽庫，通過 4 輪建庫而成，含有 15 億的環(huán)肽分子。

▐  第二步：DEL 親和篩選。

研究人員分別做了 5 個篩選條件，篩選的蛋白分別是 Mcl-1 (172−327)，Mcl-1 (172−327) with 80 μM BIM peptide，Mcl-1  (33−327)，Bcl-xl (和 Mcl-1 屬于同一家族，需要做出選擇性) 以及 No target (陰性對照)。

▐  第三 ~ 四步：DNA 解碼和數(shù)據(jù)分析。 

通過深度測序?qū)Σ煌�篩選條件的結(jié)果進行解碼并分類統(tǒng)計分析，可以發(fā)現(xiàn)許多富集度很高的分子砌塊組合在不同的篩選條件中都被鑒定出來。所有這些化合物在長和短的 Mcl-1 中都有富集，并且和 BIM 肽具有競爭關(guān)系，同時大多數(shù)富集化合物對脫靶蛋白 Bcl-xl 也有富集�？上攵�知發(fā)現(xiàn)選擇性靶向 Mcl-1 而非靶向 Bcl-xl 的分子的困難性是很高的。

圖 3b,3c 三維立方圖 x 軸，y 軸代表不同建庫階段的分子砌塊，Z 軸為富集結(jié)果，藍色點為富集度好的含有 2 種分子砌塊的系列分子 ，圖 3d 為綜合分析后，選出的選擇性靶向 Mcl-1，且富集度好的一系列分子砌塊信息，基于該信息可以推測出活性分子的結(jié)構(gòu)。

▐  第五步：off-DNA 合成和活性驗證。

如圖 3e 所示，DEL 篩選出的大環(huán)化合物 (1/2/3) 與 Mcl-1 具有可觀的結(jié)合親和力 (50-130 nM)，且對 Bcl-xl 沒有活性，是非常好的起始優(yōu)化分子。同時因為這些分子屬于半肽類分子，研究人員也測了代謝穩(wěn)定性，結(jié)果表明這些分子具有足夠的代謝穩(wěn)定性用于下一步的分子改造。此外，這 3 個大環(huán)分子的細胞活性測試結(jié)果較差，同時溶解性也較差，因此接下來的工作主要在優(yōu)化分子的細胞活性和理化性質(zhì)上。

圖 3. DEL 篩選發(fā)現(xiàn)苗頭分子流程^[1]。

(a) DEL 篩選工作流程，I：設(shè)計與合成 DNA 編碼化合物庫；II：通過親和篩選找到和靶蛋白有親和力的分子；III：使用深度測序 DNA 標簽對選擇輸出進行表征；IV：通過統(tǒng)計分析鑒定富集化合物；V：合成代表性 Off-DNA 化合物；VI：生物活性驗證。(b-c) 四環(huán)肽 DEL 庫針對 Mcl-1 (172-327) 篩選的富集數(shù)據(jù)分析，藍色點代表富集度好的化合物系列；(d)“SAR”信息體現(xiàn)富集度高的四輪建庫分子砌塊中。(e) Off-DNA 分子活性驗證：^aIC₅₀ values determined in an Mcl-1-BAK time-resolved fluorescence resonance energy transfer  (TR-FRET) assay；^bIC₅₀ values determined in an NCI-H929 cell viability assay；^cIC₅₀ values determined in a Bcl-xl-BAK TR-FRET assay。

 
03
共晶結(jié)構(gòu)：化合物改構(gòu)的關(guān)鍵指導

如圖 4，研究人員詳細分析了化合物 1 和 Mcl-1 蛋白的結(jié)合模式，該大環(huán)分子在 P1-P4 口袋都占據(jù)，占據(jù) P3, P4 口袋的片段相互作用比較多。

其中，Phe-Phg 片段占據(jù) P4 口袋，苯丙氨酸側(cè)鏈貼著由 Phe318/319 形成的疏水表面，同時占據(jù)了由纈氨酸 216、220、265 和甘氨酸 262 形成的小的疏水口袋。形成大環(huán)的肽鏈在該區(qū)域有不少的氫鍵作用，順式氨基環(huán)己基乙酸片段位于 P3 口袋，其羰基與 His-224 形成氫鍵作用，同時該順式構(gòu)型對誘導分子其他片段更深入的進入 P1 口袋有非常重要的作用。
 

 
位于 P1 和 P2 口袋的片段形成的相互作用不是很多，主要是疏水作用。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)許多已報道的 Mc1-1 抑制劑占據(jù)了 P1’誘導口袋，然而化合物 1 沒有占據(jù)該區(qū)域，并且該誘導口袋看起來沒有出現(xiàn)。

為了進一步研究 P1/P1’口袋，如圖 5，研究人員將化合物 1 的復合物共晶結(jié)構(gòu)與另一個 Mcl-1 抑制劑的共晶結(jié)構(gòu)疊合，可以明顯的看出 P1’口袋還有更多的優(yōu)化空間，因此接下來的優(yōu)化工作主要集中對 P1’口袋處的小分子側(cè)鏈進行優(yōu)化。

圖 5. 化合物 1與 Mcl-1 蛋白共晶結(jié)構(gòu)與已報道 Mcl-1 抑制劑復合物共晶結(jié)構(gòu)疊合圖 (PDB 5FDR) ^[1]。

   
04
改構(gòu)：提升活性，優(yōu)化理化性質(zhì)

如表 1，化合物 (34-37) 在 R 處引入苯環(huán)占據(jù) P1 口袋，活性即有提升。化合物 (38-42) 引入更長的聯(lián)苯炔，活性得到顯著的提升。其中對叔丁基苯基衍生物 41 的酶活為 1.8 nM。
盡管酶活有所提升，但在細胞活性方面未觀察到改善，在 H929 增殖和 Caspase 檢測中，IC₅₀ 值仍然在低微摩爾范圍內(nèi)。

研究人員假設(shè)是由于該大環(huán)分子的剛性結(jié)構(gòu)以及聯(lián)苯，聯(lián)苯炔都缺乏柔性，從而透膜性不好，于是引入略微靈活的芳基醚來解決該問題，結(jié)果表明化合物 43 和 44 的酶活以及細胞活性都提升到納摩爾級別。

雖然對 P1'-口袋的優(yōu)化將活性提升 2 個數(shù)量級，但是 cLogD 顯著增加，從化合物 3 的 5.1 增加到化合物 44 的 8.2，化合物 44 的溶解性低于 2 μM。因此，需要進一步優(yōu)化分子整體的理化性質(zhì)。

如表 2，基于前期的相互作用分析，主要對 R1，R2，R3 和 R4 基團進行微調(diào)，具體的方法主要是引入雜原子和極性基團來降低 cLogD。最終找到 57,59 這兩個分子，具有可觀的細胞活性，適當?shù)耐改ば院蛢?yōu)秀的溶解性，適合未來進一步的開發(fā)用于疾病的治療。

表 2. 理化性質(zhì)優(yōu)化^[1]。

 

MCE 的 DEL 庫：

MCE 擁有 68 個多樣性的 DEL 庫，如優(yōu)勢骨架型、天然產(chǎn)物類似物型、環(huán)肽型、共價型等，含數(shù)十億 DEL 分子，可進一步通過高通量測序技術(shù)，解碼 DEL 分子的專屬 DNA 標簽，快速獲得針對靶點的苗頭化合物信息。這些 DEL 分子代表的化學結(jié)構(gòu)新穎，化學空間覆蓋范圍廣，具備類藥分子特性。結(jié)合平臺強大的 DEL 庫個性化定制、重組蛋白定制、先導化合物優(yōu)化技術(shù)及豐富的項目經(jīng)驗，MCE 可真正提供一站式 DEL 庫及 DEL 庫篩選服務。

05
小結(jié)

以上，小 M 給大家分享了一篇比較完整的基于 DEL 環(huán)肽庫的篩選案例，希望可以幫助大家更進一步的了解 DEL 篩選~

產(chǎn)品推薦

DNA 編碼化合物庫合成與篩選 DNA 編碼化合物庫（DNA Encoded compound Library, DEL）技術(shù)作為新穎、強大的苗頭化合物發(fā)現(xiàn)引擎，可快速從幾千萬至數(shù)十億分子中，遴選出結(jié)構(gòu)新穎、具有潛在成藥性的化合物，大大縮短藥物研究周期，降低研發(fā)成本。在 DEL 庫中，每一個分子砌塊（Building Block）都由一段已知唯一的 DNA 序列進行標記，通過 DNA 兼容反應和組合化學模式，歷經(jīng)數(shù)個循環(huán)即可獲得上億 DEL 分子。數(shù)十億化合物可以混合在一管中篩選，最終通過高通量測序技術(shù)，解碼 DEL 分子的專屬 DNA 標簽，快速獲得針對靶點的苗頭化合物信息。

50K Diversity Library 由 50,000 種類藥化合物組成。本多樣性庫具備新穎性、類藥性，結(jié)構(gòu)多樣性等特點，庫中化合物可重復供應，是新藥研發(fā)的有力工具，可以廣泛地應用于高通量篩選 (HTS) 和高內(nèi)涵篩選 (HCS)。

5K Scaffold Library 由 5,000 種類藥化合物組成，每種化合物代表一種結(jié)構(gòu)骨架，最大程度保證了庫的結(jié)構(gòu)多樣性。庫中的化合物均經(jīng)過 MedChem & PAINS filters 篩選，剔除了不合適的化學結(jié)構(gòu)，避免“目標錯誤”。本庫化合物數(shù)量少但結(jié)構(gòu)足夠多樣，是藥物篩選的有力工具。

3D Diverse Fragment Library 由 5,196 個非平面片段分子組成（平均 Fsp3 值為 0.58），超過 4,700 個片段至少包含一個手性中心。本庫設(shè)計的關(guān)鍵元素是 3D 結(jié)構(gòu)、多樣性、生物反應性等，有效提高了片段潛在生物活性，為基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)提供了更高的片段命中概率。

Drug Fragment Library MCE Drug Fragment Library 由 1,000 個藥物片段組成。這些藥物片段來自 2,946 個 FDA 已批準的藥物分子，同一藥物的不同片段可以出現(xiàn)在其他藥物中，這些片段和 PK/PD 性質(zhì)存在一定的相關(guān)性，基于片段的篩選可以為后續(xù)優(yōu)化結(jié)構(gòu)預留出足夠的化學空間，該化合物庫是 FBDD（基于片段的藥物設(shè)計）藥物篩選的必備工具。

參考文獻：
[1]. Hekking KFW, et al. Development of Potent Mcl-1 Inhibitors: Structural Investigations on Macrocycles Originating from a DNA-Encoded Chemical Library Screen. J Med Chem. 2024 Feb 22;67 (4):3039-3065.