動物活體成像之生物發(fā)光實驗技巧及注意事項
通過上期的介紹，我們已經(jīng)知道，生物發(fā)光和熒光作為最常見兩種光學(xué)成像技術(shù)，各有特點。其中生物發(fā)光技術(shù)因其背景噪音低，靈敏度高等優(yōu)點，在腫瘤，分子互作及信號傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。當兩種方法都適用于研究對象時，更推薦用生物發(fā)光標記方法開展成像實驗。
一個完整的生物發(fā)光實驗流程，至少應(yīng)包括實驗設(shè)計（選擇合適的熒光素酶報告基因和熒光素底物）、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染（將熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染至細胞中，使其表達熒光素酶）、動物模型準備（選擇適當?shù)膭游锬Ｐ�，并根�?jù)需要進行基因編輯或誘導(dǎo)特定病理狀態(tài)）、細胞注射或移植（將標記細胞注射或移植到動物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統(tǒng)，在預(yù)定的時間點捕捉生物發(fā)光信號）等。
本期，我們將深入探討生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)的實驗技巧，從熒光素的選擇到實驗結(jié)果的分析，逐一探討生物發(fā)光實驗的注意事項及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學(xué)反應(yīng)是生物發(fā)光的基礎(chǔ)，選擇合適的發(fā)光酶和底物是實驗成功的第一步。生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)常用的發(fā)光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實驗一般選用螢火蟲螢光素酶，有時也會用海腎螢光素酶。
二者區(qū)別如下表所示：
體外驗證
將構(gòu)建的細胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動物活體成像系統(tǒng)觀測，然后進行生物發(fā)光的定量分析。
計算單個細胞單位時間發(fā)出的光子數(shù)，當數(shù)值大于100時，適合進行體內(nèi)實驗，數(shù)值過低或過高，都不適合體內(nèi)成像或長期觀測。將定量數(shù)據(jù)繪制標準曲線，計算標準差，線性好證明細胞表達穩(wěn)定，線性差則表明熒光素酶表達不穩(wěn)定，同樣不適合進行體內(nèi)實驗。
細胞接種
確保細胞是在良好的生長狀態(tài)下，并且已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細胞計數(shù)器或自動細胞計數(shù)儀對細胞進行準確計數(shù)。接種部位和數(shù)量應(yīng)根據(jù)實驗需求進行調(diào)整，將細胞接種到實驗動物體內(nèi)。確保細胞在體內(nèi)生長、擴散，以產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實驗動物體內(nèi)。實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。
靜脈注射（i.v.）：血液運輸，靈敏度高，重復(fù)性好。信號來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據(jù)實驗?zāi)康暮蛣游锬Ｐ偷奶攸c，選擇合適的注射方式。注射時，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發(fā)光信號在體內(nèi)均勻分布。
體內(nèi)預(yù)實驗確定最佳成像條件
在正式實驗前，進行預(yù)實驗以確定發(fā)光時間線和最佳拍攝時間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，十分鐘后強度達到最高。在最高點持續(xù)約20-30分鐘后開始衰落，約三小時后發(fā)光全部消失。所以最好的檢測時間是在注射后15-35分鐘內(nèi)。
成像設(shè)備的選擇
在生物發(fā)光實驗中，合適的儀器對確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性至關(guān)重要。
理想的成像儀器應(yīng)具備以下特點：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測低水平的信號，這對于早期疾病檢測和微小變化的監(jiān)測至關(guān)重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動態(tài)范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學(xué)過程。
3. 寬動態(tài)范圍
儀器應(yīng)具有寬廣的動態(tài)范圍，能夠同時檢測到從低到高的信號強度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號和高質(zhì)量的圖像。儀器的背景噪聲應(yīng)盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環(huán)境適應(yīng)性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設(shè)備，且能夠適應(yīng)不同的實驗條件和樣本類型。考慮儀器與其他實驗設(shè)備的兼容性，以及未來升級或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術(shù)支持和服務(wù)
確保在遇到操作或技術(shù)問題時能夠得到及時有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發(fā)光實驗儀器，將有助于提高實驗的成功率和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
實驗結(jié)果判讀和分析
獲取高質(zhì)量的成像數(shù)據(jù)只是研究的一部分，結(jié)果的判讀與數(shù)據(jù)分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價值的信息，并得出科學(xué)結(jié)論。
1. 圖像優(yōu)化處理：采用軟件對拍攝到的圖像進行優(yōu)化處理、灰度調(diào)節(jié)、偽彩色處理等，以提高圖像質(zhì)量。
2. 定義感興趣區(qū)域（ROI）：計算發(fā)光強度、發(fā)光面積、發(fā)光信號變化等參數(shù)，分析實驗結(jié)果。可使用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行處理，以得出有意義的結(jié)論。
3. 多圖分析：不同時間點成像結(jié)果的分析要用到多圖分析，數(shù)據(jù)歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計算，生成動力學(xué)曲線、批量導(dǎo)出圖片及動態(tài)展示等提高了結(jié)果的可讀性和理解性。
結(jié)論
綜上所述，生物發(fā)光活體成像在實驗過程中涉及多個環(huán)節(jié)，掌握各個方面的技巧和方法對于獲得可靠、準確的實驗結(jié)果至關(guān)重要。
一個完整的生物發(fā)光實驗流程，至少應(yīng)包括實驗設(shè)計（選擇合適的熒光素酶報告基因和熒光素底物）、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染（將熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染至細胞中，使其表達熒光素酶）、動物模型準備（選擇適當?shù)膭游锬Ｐ�，并根�?jù)需要進行基因編輯或誘導(dǎo)特定病理狀態(tài)）、細胞注射或移植（將標記細胞注射或移植到動物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統(tǒng)，在預(yù)定的時間點捕捉生物發(fā)光信號）等。
本期，我們將深入探討生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)的實驗技巧，從熒光素的選擇到實驗結(jié)果的分析，逐一探討生物發(fā)光實驗的注意事項及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學(xué)反應(yīng)是生物發(fā)光的基礎(chǔ)，選擇合適的發(fā)光酶和底物是實驗成功的第一步。生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)常用的發(fā)光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實驗一般選用螢火蟲螢光素酶，有時也會用海腎螢光素酶。
二者區(qū)別如下表所示：
體外驗證
將構(gòu)建的細胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動物活體成像系統(tǒng)觀測，然后進行生物發(fā)光的定量分析。
計算單個細胞單位時間發(fā)出的光子數(shù)，當數(shù)值大于100時，適合進行體內(nèi)實驗，數(shù)值過低或過高，都不適合體內(nèi)成像或長期觀測。將定量數(shù)據(jù)繪制標準曲線，計算標準差，線性好證明細胞表達穩(wěn)定，線性差則表明熒光素酶表達不穩(wěn)定，同樣不適合進行體內(nèi)實驗。
細胞接種
確保細胞是在良好的生長狀態(tài)下，并且已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細胞計數(shù)器或自動細胞計數(shù)儀對細胞進行準確計數(shù)。接種部位和數(shù)量應(yīng)根據(jù)實驗需求進行調(diào)整，將細胞接種到實驗動物體內(nèi)。確保細胞在體內(nèi)生長、擴散，以產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實驗動物體內(nèi)。實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。
靜脈注射（i.v.）：血液運輸，靈敏度高，重復(fù)性好。信號來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據(jù)實驗?zāi)康暮蛣游锬Ｐ偷奶攸c，選擇合適的注射方式。注射時，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發(fā)光信號在體內(nèi)均勻分布。
體內(nèi)預(yù)實驗確定最佳成像條件
在正式實驗前，進行預(yù)實驗以確定發(fā)光時間線和最佳拍攝時間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，十分鐘后強度達到最高。在最高點持續(xù)約20-30分鐘后開始衰落，約三小時后發(fā)光全部消失。所以最好的檢測時間是在注射后15-35分鐘內(nèi)。
麻醉方法
為減少實驗動物在成像過程中的運動干擾，需對其進行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動物在成像過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證獲得的實驗數(shù)據(jù)準確可靠，又能最大限度地保障動物福利，確保其安全。實驗動物一般較難合作，因此實驗中常采用全身麻醉，根據(jù)麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
為減少實驗動物在成像過程中的運動干擾，需對其進行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動物在成像過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證獲得的實驗數(shù)據(jù)準確可靠，又能最大限度地保障動物福利，確保其安全。實驗動物一般較難合作，因此實驗中常采用全身麻醉，根據(jù)麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
生物發(fā)光實驗可以在底物注射后再進行麻醉。
吸入麻醉與注射麻醉的區(qū)別如下表：
在生物發(fā)光實驗中，合適的儀器對確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性至關(guān)重要。
理想的成像儀器應(yīng)具備以下特點：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測低水平的信號，這對于早期疾病檢測和微小變化的監(jiān)測至關(guān)重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動態(tài)范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學(xué)過程。
3. 寬動態(tài)范圍
儀器應(yīng)具有寬廣的動態(tài)范圍，能夠同時檢測到從低到高的信號強度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號和高質(zhì)量的圖像。儀器的背景噪聲應(yīng)盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環(huán)境適應(yīng)性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設(shè)備，且能夠適應(yīng)不同的實驗條件和樣本類型。考慮儀器與其他實驗設(shè)備的兼容性，以及未來升級或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術(shù)支持和服務(wù)
確保在遇到操作或技術(shù)問題時能夠得到及時有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發(fā)光實驗儀器，將有助于提高實驗的成功率和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
實驗結(jié)果判讀和分析
獲取高質(zhì)量的成像數(shù)據(jù)只是研究的一部分，結(jié)果的判讀與數(shù)據(jù)分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價值的信息，并得出科學(xué)結(jié)論。
1. 圖像優(yōu)化處理：采用軟件對拍攝到的圖像進行優(yōu)化處理、灰度調(diào)節(jié)、偽彩色處理等，以提高圖像質(zhì)量。
2. 定義感興趣區(qū)域（ROI）：計算發(fā)光強度、發(fā)光面積、發(fā)光信號變化等參數(shù)，分析實驗結(jié)果。可使用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行處理，以得出有意義的結(jié)論。
3. 多圖分析：不同時間點成像結(jié)果的分析要用到多圖分析，數(shù)據(jù)歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計算，生成動力學(xué)曲線、批量導(dǎo)出圖片及動態(tài)展示等提高了結(jié)果的可讀性和理解性。
結(jié)論
- 研究進展：視頻引導(dǎo)的手持式高速光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)
- ULTIMUS 9 LAB小動物超分辨超聲成像系統(tǒng)產(chǎn)品技術(shù)應(yīng)用動態(tài)
- 利用新型多光譜短波紅外成像評估人體燒傷創(chuàng)面的深度
- 光學(xué)相干層析成像（OCT）多種焦深拓展策略分析
- 西妥昔單抗標記臨床腫瘤樣本對比近紅外和短波紅外成像效果
- 通過Au-Se鍵克服金納米顆粒的肝臟生物轉(zhuǎn)化障礙以增強體內(nèi)活性靶向
- 非接觸式短波紅外成像用于閉眼下的動態(tài)快速瞳孔測量和凝視評估
- 利用短波紅外拉曼散射實現(xiàn)宏觀無標記的生物醫(yī)學(xué)成像
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com