在腫瘤演化過(guò)程中，腫瘤始于單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞通過(guò)隨機(jī)的突變形成克隆擴(kuò)增，進(jìn)而積累更多突變實(shí)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化。但僅有少數(shù)克隆能轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤，其背后的機(jī)制尚不清楚。

為了解答這一疑問(wèn)，蘇黎世大學(xué)以及蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種 CRISPR 策略，系統(tǒng)地記錄了在胚胎階段中的克隆擴(kuò)情況，并揭示了腫瘤發(fā)生與克隆擴(kuò)增密切的分子過(guò)程，相關(guān)內(nèi)容以 In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution 為題發(fā)表于 Nature。
 

驅(qū)動(dòng)克隆擴(kuò)增的突變集中于TNF信號(hào)通路
研究人員首先對(duì) CROP-seq 系統(tǒng)進(jìn)行了調(diào)整，將基因盒中的puromycin替換為mCherry熒光標(biāo)記，并使用 TargetMol 的 5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU）作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）選擇感染的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因干擾的監(jiān)測(cè)和分析。然后通過(guò)子宮內(nèi)病毒微注射、單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和導(dǎo)向捕獲（guide capture）等技術(shù)，系統(tǒng)地研究了 150 個(gè)常見的癌基因在克隆擴(kuò)增和腫瘤發(fā)生中的作用。

在進(jìn)行基因干擾后，對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期觀察，并收集樣本進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 測(cè)序。通過(guò)計(jì)算每個(gè)基因干擾對(duì)小鼠的表皮干細(xì)胞（EpSCs）的差異基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)許多 驅(qū)動(dòng)克隆擴(kuò)增的突變與腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路的基因表達(dá)高度相關(guān)。

例如，在 P60（小鼠出生后60天）細(xì)胞群的 44 個(gè)基因模塊中，占主導(dǎo)地位的一個(gè)主要基因模塊就包含了 25 個(gè)與 TNF 信號(hào)相關(guān)的基因。
 

▲上皮細(xì)胞的克隆擴(kuò)增集中于TNF信號(hào)通路

小貼士
TNF 信號(hào)主要通過(guò) TNF 配體與 TNF 受體1（TNFR1）結(jié)合激活，涉及 JUN 和 NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為了測(cè)試 TNF 通路在上皮克隆擴(kuò)增中的作用，研究人員使用超聲引導(dǎo)的子宮內(nèi)病毒微注射在胚胎中靶向 150 個(gè)癌基因，隨后，比較了在野生型和 Tnfrsf1a^+/− 小鼠 P60 皮膚中的擴(kuò)張率。

結(jié)果顯示，在 P60 小鼠皮膚中，TNFR1 主要在 EpSCs 和毛囊干細(xì)胞中表達(dá)，幾乎所有的克隆擴(kuò)增都高度依賴于 TNFR1，且高表達(dá)TNF基因模塊的克隆擴(kuò)增率較高。

而 TNF 主要由巨噬細(xì)胞分泌，盡管在后天階段巨噬細(xì)胞的去除并未完全阻止克隆擴(kuò)增，但它們?cè)诒砥さ目寺�擴(kuò)增中起到了重要的促進(jìn)作用。這表明巨噬細(xì)胞可能是 TNF 的一個(gè)重要來(lái)源。
 

▲克隆擴(kuò)增是通過(guò)TNF介導(dǎo)的

自分泌的TNF基因程序
接下來(lái)，研究人員測(cè)試了 TNF 通路在克隆擴(kuò)增與腫瘤演化中的作用。

通過(guò)在小鼠模型中注射靶向 150 個(gè)癌基因的 sgRNA 庫(kù)，并在特定時(shí)間點(diǎn)（P60）進(jìn)行化學(xué)致癌處理，觀察腫瘤的形成和發(fā)展。然后使用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，識(shí)別出不同的腫瘤細(xì)胞群體，發(fā)現(xiàn)在 克隆擴(kuò)增向腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)下調(diào)用于克隆擴(kuò)增的TNF模塊，并切換到自分泌TNF-MMP9和MMP10軸，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的進(jìn)展，使得腫瘤變得更具侵襲性。并且 TNF 特征與鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）患者的較短總體生存期相關(guān)。
 

▲癌細(xì)胞切換到自分泌的TNF基因程序

小結(jié)
綜上，該研究建立了一個(gè)體內(nèi)單細(xì)胞 CRISPR 平臺(tái)，系統(tǒng)地解析了常見的 150 種癌基因在在克隆擴(kuò)增和腫瘤發(fā)生中的作用。發(fā)現(xiàn) 腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路是介導(dǎo)克隆擴(kuò)增的癌癥易感性的重要因素。

研究發(fā)現(xiàn)部分由巨噬細(xì)胞來(lái)源的 TNF 刺激的表皮干細(xì)胞（EpSCs）中的 TNF 信號(hào)基因模塊，是表型正常皮膚中克隆擴(kuò)增的通用驅(qū)動(dòng)因素。而在從克隆擴(kuò)增到腫瘤發(fā)生的過(guò)渡過(guò)程中，這一信號(hào)模塊被下調(diào)，侵襲性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)向一種與基質(zhì)重塑因子如 MMP9 和 MMP10 相關(guān)的自分泌 TNF 基因程序，以促進(jìn)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的侵襲性特性。為開發(fā)新的癌癥預(yù)防和治療策略提供了基礎(chǔ)。
 

腫瘤進(jìn)化中不同的TNF程序模型

科研助力

腫瘤壞死因子（TNF）是一種細(xì)胞信號(hào)蛋白（細(xì)胞因子），參與系統(tǒng)性炎癥，并且是急性期反應(yīng)中的細(xì)胞因子之一。它主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，但也可以由許多其他細(xì)胞類型產(chǎn)生，如CD4+淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。當(dāng)下，TNF相關(guān)研究如火如荼，TargetMol可提供多種TNF相關(guān)抑制劑、化合物庫(kù)以及重組蛋白助力相關(guān)研究，歡迎咨詢~

原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07663-y