使用1064nm激光驅(qū)動進行深部腫瘤治療
本文要點：吸收帶位于第二近紅外（NIR-II，1000-1700nm）窗口的小型有機光熱劑（PTA）非常適合對抗深部腫瘤。然而，目前報道的吸收NIR-II的PTA仍然存在低摩爾消光系數(shù)（MEC，ε）、化學穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性不足以及治療過程中需要高光功率密度等問題。在此，本文開發(fā)了一系列BF2橋聯(lián)Azafulvene二聚體受體集成的小型有機PTA。π共軛Azafulvene二聚體骨架中的B-N配位鍵賦予其強大的吸電子能力，促進了具有NIR-II吸收的強供體-受體-供體（D-A-D）結(jié)構(gòu)的PTAs。值得注意的是，PTA即OTTBF顯示出高MEC（7.21×104 M−1 cm−1）、超高的化學和光穩(wěn)定性。在封裝到水分散性納米粒子中后，OTTBF NPs可以在1064 nm的照射下實現(xiàn)顯著的光熱轉(zhuǎn)換效果，光密度低至0.7 W cm−2，這是目前所知的PTT過程中使用的最低NIR-II光功率。此外，OTTBF NPs已成功應用于1064nm激光下的體外和體內(nèi)深層癌癥治療。本研究為未來探索用于生物醫(yī)學應用的多功能D-A-D結(jié)構(gòu)NIR-II吸收有機PTA提供了見解。
圖1. OTTBF設計及工作原理
目前，成功的 NIR-II PTA 通常需要：1） NIR-II 區(qū)域的吸收波長，2）該區(qū)域的高 MEC （ε） 以最大限度地提高光收集，3） 理想的光熱轉(zhuǎn)換效率以實現(xiàn)有效的癌細胞消融，以及 4） 高穩(wěn)定性，包括 PTT 過程中的化學穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。本文開發(fā)了一種出色的二氟化硼橋連azafulvene二聚體（簡稱BF2BAD） 受體整合的小有機 PTA （OTTBF） 與 NIR-II 吸收用于光子熱療，以對抗深部腫瘤。π共軛氮黃烯二聚體主鏈中的B-N配位鍵賦予其強大的吸電子能力，促進了充滿活力的D-A-D結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強烈的NIR-II吸收帶。OTTBF 的 MEC 在 892 nm處為 7.21×104 M−1cm−1，即使在 1064 nm 中它仍然高達 1.68×104 M−1cm−1。通過使用兩親性聚合物DSPE-PEG2000為了形成水分散性納米顆粒（NPs），OTTBF NPs在1064 nm輻照下，光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE，η=54.1 %）可以顯著提高溫度，光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE，η =54.1 %），光密度低至0.7 W cm−2，這可能是我們所知的光熱腫瘤治療中報告的最低的 NIR-II 光功率。此外，超高的化學穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性使OTTBF NPs更適合生物應用。此外，還進行了全面的理論計算，以深入了解光激發(fā)時的結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)以及弛豫過程。由于其優(yōu)異的優(yōu)點，OTTBF NPs有望應用于0.7 W cm−2以下的體外和體內(nèi)深部腫瘤治療1064 nm 激光器。該研究不僅提出了一種高性能的NIR-II活化小型有機PTA，而且為未來D-A-D結(jié)構(gòu)NIR-II吸收PTAs的生物醫(yī)學應用設計提供了通用指南和探索。
圖2. BF2橋連azafulvene二聚體
前人研究表明，分子內(nèi)B-N配位鍵的形成可以增強π共軛骨架的吸電子能力。最近報道了一種新型的二氟化硼橋連azafulvene二聚體（BF2BAD）復合物，它在azafulvene單元中表現(xiàn)出增強的π共軛，使其成為構(gòu)建近紅外染料的強電子吸收構(gòu)建單元（圖 2a ）。本研究設計合成了3種新的PTA（TPEBF、TPABF和OTTBF），其中BF2BAD是電子受體，電子給體分別是四苯乙烯（TPE），三苯胺（TPA）和烷氧基取代的TPA（圖2b和2c）。此外，TPEBF和TPABF中的噻吩充當π共軛介質(zhì)，同時引入了兩條烷基鏈以增強疏水性并減少分子間相互作用。對 808 nm 和 1064 nm 之間的透射率進行了比較。激光探測器覆蓋有不同厚度的雞胸組織（0、2、4、6、8 和 10 mm），然后在 808 nm 或 1064 nm 處照射，功率密度為 0.33、0.7 或 1 W cm−2（圖 2d）。如圖 2e 所示，與 808 nm 激光器相比，1064 nm 激光器無論激光功率如何，都表現(xiàn)出更出色的透射率，使其更適合于深度 PTT。研究了THF溶液中3種分子的光物理性質(zhì)。TEPBF、TPABF和OTTBF的最大吸收波長位于714 nm處（ε=6.34×104M−1cm−1）， 758 nm（ε=6.73×104 M−1cm−1和 892 nm （7.21×104M−1cm−1），分別（圖2f）。此外，TPEBF和TPABF的吸收波長在1000 nm以上的區(qū)域消失，而OTTBF可以擴展到1100 nm，在 1064 nm 處甚至保持1.68×104 M−1cm−1的高ε，這使OTTBF 在 NIR-II 窗口中具有很高的光捕獲能力。同時，三種分子在甲苯中表現(xiàn)出792 nm、880 nm和1058 nm的熒光發(fā)射（圖2g）。
圖3. TPEBF NP、TPABF NP和OTTBF NP表征
然后，先使用生物相容性兩親性聚合物DSPE-PEG2000將疏水分子封裝成納米顆粒（NPs）（圖3a）。透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs表現(xiàn)出一致的球形形貌，直徑分別約為93 nm、102 nm和97 nm，小于動態(tài)光散射（DLS）結(jié)果（133 nm、130 nm和128 nm）（圖3b）。值得注意的是，與 TPEBF NPs 和 TPABF NPs 相比，OTTBF NPs 在 1000–1400 nm 的 NIR-II 窗口范圍內(nèi)顯示出更寬的吸收，表明它是一種很有前途的在 NIR-II 區(qū)域?qū)崿F(xiàn)光熱抗腫瘤的 PTA分子（圖 3c）。盡管用于生物應用的 1064 nm 的 MPE 為 1 W cm−2，采用較低的激光功率可增強生物樣品的相容性。本文采用了 0.7 W cm−2 的激光功率密度在1064 nm 處評估 NPs 的光熱效應。如圖3d和圖3e所示，在1064 nm激光（0.70 W cm−2） 5 分鐘。相比之下，TPEBF NPs和TPABF NPs的溫度僅略有升高，分別為27.9 °C和36.4 °C。3種NPs的光熱效應差異歸因于它們在NIR-II窗口中的不同吸收能力。OTTBF NPs在808 nm處的最高溫度增量比較（0.33 W cm−2為31.5 °C），50.5 °C 代表 0.70 W cm−2）和 1064 nm（54.8 °C 為 0.70 W cm−2）還表明，OTTBF NPs在NIR-II區(qū)域中的光熱轉(zhuǎn)換比在NIR-I區(qū)域中具有更好的光熱轉(zhuǎn)換（圖3f）。為了全面比較NIR-I和NIR-II激光器的深層組織光熱轉(zhuǎn)換能力，記錄了OTTBF NPs在被不同厚度的雞組織覆蓋后，再在相同功率密度（0.7 W cm−2）下以808 nm或1064 nm輻照5 分鐘后的最大溫度增量。圖3g所示的結(jié)果表明，無論覆蓋的組織厚度如何，照射1064 nm的OTTBF NPs的溫度增量都高于808 nm的溫度增量。此外，OTTBF NPs的溫度升高表現(xiàn)出激光功率密度和NPs濃度依賴性行為（圖3h和3i）。TPEBF NPs和TPABF NPs在808 nm（0.33 W cm−2）的輻照下也表現(xiàn)出相似的行為。TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE，η）分別為22.5、37.3和54.1%（圖3j和S5）。通過記錄交替加熱和冷卻動作過程中的溫度變化，進一步研究了OTTBF NPs的光穩(wěn)定性。經(jīng)過五個循環(huán)后，OTTBF NPs的最高溫度變化可以忽略不計（圖3k）。通過檢測NPs的吸收強度，研究了NPs的光漂白性能和ROS抗性。在 808 nm 激光 （0.33 W cm−2） 或 1064 nm 激光器 （0.7 W cm−2），OTTBF NPs的吸收強度變化可以忽略不計。然而，在相同條件下，吲哚菁綠（ICG）和ICG NPs的吸收強度急劇下降（圖3l）。OTTBF NPs和ICG的比較圖也顯示在圖3n中。在存在各種ROS的情況下，例如次氯酸鹽（ClO−）、叔丁基過氧自由基（TBO⋅）和羥基自由基（⋅OH）在濃度為200μM時，ICG的吸收強度比其原始值下降約95%（圖3m）。然而，在相同條件下，OTTBF NPs的吸收強度保持不變。TPEBF NPs和TPABF NPs也表現(xiàn)出與OTTBF NPs一樣相對較高的化學和光穩(wěn)定性。此外，三種NPs在不同pH值的溶液中表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明了BF2BAD 受體集成的小型有機 PTA 具有高穩(wěn)定性和，OTTBF NPs 具有出色的光熱轉(zhuǎn)換能力，使其非常適合生物 PTT 應用。
圖4. TPEBF、TPABF和OTTBF的理論計算
為了更深入地了解TPEBF、TPABF和OTTBF之間光物理特性的差異，使用密度泛函理論（DFT）和含時DFT（TD-DFT）計算進行了全面的理論研究。在M06-2X-D3/6-31G（d）水平上，使用DFT方法對三個分子的基態(tài)幾何結(jié)構(gòu)進行了全面優(yōu)化。在基態(tài)，三個分子的LUMO主要位于二氟化硼橋聯(lián)的氮雜富烯二聚體受體基團的中心核上，而HOMO在整個共軛骨架中基本上是離域的（圖4a）。OTTBF（3.00eV）中HOMO和LUMO之間的能隙比TPEBF（3.52eV）和TPABF（3.25eV）中的能隙窄，導致吸收波長發(fā)生紅移。此外，還計算了垂直激發(fā)下TPEBF、TPABF和OTTBF碎片（受體核心和其他部分）之間的電荷轉(zhuǎn)移量。圖4b顯示的結(jié)果表明，與TPEBF（0.41887 e）和TPABF（0.50787 e）相比，OTTBF具有最大的電荷轉(zhuǎn)移量（0.55751 e），導致最強的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應。這與OTTBF觀察到的最長吸收波長一致。無論是在基態(tài)還是激發(fā)態(tài)，在OTTBF中噻吩和相鄰苯環(huán)之間的二面角是三個分子中最小的。OTTBF的相對平面幾何形狀解釋了上述吸收光譜實驗中觀察到的較高MEC值。
然后計算三個分子的重組能（λ），以定量評估它們在光激發(fā)下的幾何弛豫程度，即分子內(nèi)運動。還提供了鍵長、鍵角和二面角對總λ的貢獻（圖4c-e）。TPEBF、TPABF和OTTBF的總λ分別計算為1772 cm-1、1792 cm-1和1978 cm-1。在這些分子中，OTTBF的總λ最高，表示分子內(nèi)運動最強。值得注意的是，低頻區(qū)的法向模是由二面角的變化引起的，與非輻射衰變密切相關。二面角變化對OTTBF總λ的貢獻（30.35%）明顯高于TPEBF（17.45%）和TPABF（18.72%），表明OTTBF在光激發(fā)下經(jīng)歷了更強的非輻射弛豫�？偟膩碚f，這些理論計算為TPEBF、TPABF和TPE-BFF之間的光物理性質(zhì)差異提供了合理的解釋。
圖5. OTTBF NPs 體外實驗
受到OTTBF NPs出色光熱性能的鼓舞，本文隨后評估了其對4T1和MCF-7細胞的PTT體外療效。首先，采用MTT法研究了OTTBF NPs的暗細胞毒性。如圖5a和5b所示，在與不同濃度的OTTBF NP（0-20μg/mL）孵育24小時后，細胞存活率的降低可以忽略不計，表明具有良好的生物相容性。然而，在1064 nm（0.70 W cm−2）下暴露7分鐘后，OTTBF NPs表現(xiàn)出濃度依賴性的光毒性，與20μg/mL OTTBF NPs一起孵育時，細胞存活率顯著降至11%。然后，比較了OTTBF NPs在NIR-I和NIR-II窗口下的細胞毒性。圖5c顯示的結(jié)果顯示，即使在相同的功率密度下，1064 nm激光治療組在所有濃度范圍內(nèi)也表現(xiàn)出比808 nm治療組更高的光毒性。還進行了深層癌癥細胞的光熱治療實驗，以驗證NIR-II激活的PTT的優(yōu)勢（圖2d和5d）。盡管通過以不同厚度覆蓋96孔板上的雞組織，OTTBF NPs的光毒性相應降低，但在相同條件下，1064 nm激光治療組的細胞存活率低于808 nm組。這與解決方案中的結(jié)果一致（圖3g），表明NIR-II中的PTT確實比NIR-I區(qū)域中的PTT更適合治療深層癌癥。
通過使用鈣黃綠素AM和碘化丙啶（PI）的共染色實驗進一步證實了OTTBF NPs的光療功效，其中綠色和紅色熒光信號分別對應于活細胞和死細胞。如圖5e所示，在PBS和OTTBF NPs組中可以觀察到明顯的綠色熒光信號，表明在這些實驗條件下細胞毒性可以忽略不計。然而，OTTBF NPs+1064nm組同時顯示綠色和紅色熒光，紅色信號比808nm處理組更強。同時用商業(yè)溶酶體染料（Lyso Tracker Green）和負載Cy5染料的OTTBF NPs處理4T1細胞，以研究NPs的共定位（圖5f）。Lyso Tracker的綠色通道與紅色通道表現(xiàn)出很強的相關性（重疊系數(shù)為0.80），表明OTTBF NPs通過溶酶體介導的內(nèi)吞途徑內(nèi)化到4T1細胞中。據(jù)報道，PDT或PTT可能會誘導細胞器降解并引發(fā)細胞死亡。為了研究OTTBF NPs介導的潛在溶酶體破壞，本文進行了吖啶橙（AO）染色生物成像。通常，AO在完整的溶酶體中以質(zhì)子化低聚物的形式發(fā)出紅色熒光，而在細胞質(zhì)和細胞核中，它以單體去質(zhì)子化的形式發(fā)出綠色信號。如圖5g所示，由于完整的溶酶體，在PBS和OTTBF NPs組中觀察到亮紅色熒光信號。然而，當暴露于功率密度為0.70 W cm−2的808 nm或1064 nm照射下時，AO信號的消失表明溶酶體的完整性受到嚴重破壞。通過AV-FITC/PI染色進一步研究了OTTBF NPs光熱處理誘導的細胞死亡途徑（圖5h）。用OTTBF NPs和光（808 nm或1064 nm）處理的4T1細胞顯示出比PBS和OTTBF NPs組更強的綠色和紅色熒光信號，表明處理組中出現(xiàn)了更多的細胞凋亡或壞死。
圖6. 載Cy7的OTTBF NPs（1 mg/mL，100μL）荷瘤小鼠的時間依賴性NIR-II熒光成像
受OTTBF NPs優(yōu)異的體外光熱性能的啟發(fā)，研究了體內(nèi)光子熱療抗腫瘤。由于OTTBF NPs的熒光強度相對較低，Cy7染料被共包封在NP中。首先，本文通過靜脈注射在荷瘤小鼠體內(nèi)評估了OTTBF NPs在4T1中的體內(nèi)腫瘤積聚和生物分布。如圖6a和6b所示，給藥6小時后，在腫瘤部位觀察到明顯的NIR-II熒光信號，約36小時后信號達到最大強度，表明OTTBF NPs具有顯著的腫瘤積聚能力。同時，主要器官和腫瘤的離體成像進一步證實了OTTBF NPs在腫瘤中的有效攝取和保留（圖6c和6d）。
圖7. OTTBF NPs對荷瘤小鼠進行NIR-II PPT治療
監(jiān)測小鼠的絕對腫瘤體積，以評估體內(nèi)光熱抗腫瘤作用。在NIR-I和NIR-II窗口中，OTTBF NPs介導的PTT均實現(xiàn)了顯著的腫瘤消除效果，且隨后沒有復發(fā)，這表明OTTBF NPs可以在激光照射下有效抑制腫瘤生長。此外，與808nm激光治療組相比，1064nm激光治療組顯示出略強的抑制作用。值得注意的是，僅用PBS或NPs治療的組顯示出可以忽略不計的腫瘤抑制作用，并且在整個15天的監(jiān)測期內(nèi)，它們的腫瘤大小穩(wěn)步增長（圖7d-f）。
為了了解潛在的抗腫瘤機制，在不同處理后評估了蘇木精和伊紅（H&E）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶尿苷三磷酸缺口末端標記（TUNEL）染色分析。如圖7g所示，在用OTTBF NPs+808 nm和OTTBF NPs+1064 nm處理的組的H&E染色中觀察到嚴重的腫瘤細胞壞死或凋亡。相反，在PBS和OTTBF NPs組中發(fā)現(xiàn)對癌癥細胞的損傷最小。兩個治療組的TUNEL分析也顯示了明顯的病理變化，顯示了腫瘤組織的嚴重損傷。全面研究了OTTBF NPs在PTT工藝中的生物相容性。不同處理后，荷瘤小鼠的體重沒有顯著變化（圖7h）。關鍵器官（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的H&E染色分析顯示，沒有病理異�；蜓装Y性病變。此外，不同治療組的肝（ALT、ALP和AST）和腎（BUN和UA）功能標志物沒有明顯變化，表明OTTBF NPs的肝毒性和腎毒性可以忽略不計（圖7i和7j）。
為了證實在深部腫瘤的PTT中，NIR-II窗口比NIR-I窗口的優(yōu)越性，本文通過將雞乳腺組織放置在4T1腫瘤上來模擬深層腫瘤的生長環(huán)境（圖8a）。靜脈注射OTTBF NPs后，用5mm厚的雞組織覆蓋腫瘤，然后分別用808nm（0.7W cm−2）和1064nm（0.7W cm-2）激光照射。用1064 nm激光治療的OTTBF NPs組的腫瘤溫度達到52.7°C，高于OTTBF NPs+808 nm組（47.8°C）和僅用1064納米激光治療的組（40.2°C）（圖8b和8c）。盡管與對照組（PBS治療組）相比，OTTBF NPs+808 nm治療組的腫瘤生長明顯受到抑制（腫瘤生長抑制，TGI=59%），但治療15天后，治療結(jié)果仍低于OTTBF NPs+1064 nm治療組（TGI=81%）（圖8d-f）。這種卓越的治療效果主要歸因于NIR-II窗口的高透光性以及OTTBF NPs在該區(qū)域更強的光捕獲能力。此外，在治療期間沒有觀察到小鼠體重的顯著變化（圖8g）。這些結(jié)果提供了確鑿的證據(jù)，表明OTTBF NP在NIR-II激光照射下對深部腫瘤實現(xiàn)了有效的光熱抑制。
本文開發(fā)了一種出色的NIR-II二氟化硼橋聯(lián)氮雜富烯二聚體受體集成小有機PTA（OTTBF），用于光子深部腫瘤熱療抗腫瘤治療。π共軛氮雜富烯二聚體骨架中的B-N配位鍵賦予其很強的吸電子能力，促進了充滿活力的D-a-D結(jié)構(gòu)的形成，并導致強烈的NIR-II吸收帶。OTTBF的高MEC（7.21×104 M−1 cm−1）賦予了它在NIR-II窗口中的高光捕獲能力。通過利用兩親性聚合物DSPE-PEG2000形成水分散性納米粒子（NPs），OTTBF NPs在1064 nm的光密度低至0.7 W cm−2的照射下實現(xiàn)了高達50°C的顯著溫度增強，這可能是PTT中報告的最低NIR-II光功率。此外，超高的化學和光穩(wěn)定性使OTTBF NPs更適合生物應用。綜合理論計算表明，OTTBF顯示出較低的HOMO-LUMO能隙，并在光激發(fā)下經(jīng)歷強烈的非輻射弛豫。由于其優(yōu)異的優(yōu)點，OTTBF NPs已成功應用于0.7 W cm−2 1064 nm激光下的體外和體內(nèi)深層癌癥治療。這項工作不僅提出了一種高性能的替代NIR-II激活的小型有機PTA，還為生物醫(yī)學應用的NIR-II吸收PTA的未來設計提供了總體指導和探索。
參考文獻
Yang M, Ou X, Li J, et al. BF2‐Bridged Azafulvene Dimer‐Based 1064 nm Laser‐Driven Superior Photothermal Agent for Deep‐Seated Tumor Therapy[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024: e202407307.
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