本文要點(diǎn)：NIR-II區(qū)域的可激活近紅外（NIR）成像對(duì)于深層組織生物分析物追蹤至關(guān)重要。然而，由于通用化學(xué)策略的可用性有限，設(shè)計(jì)此類探針仍然具有挑戰(zhàn)性。本文介紹了一個(gè)可激活探針的基礎(chǔ)平臺(tái)，使用分析物觸發(fā)的智能調(diào)制NIR-II發(fā)射的羅丹明雜交體的π偶聯(lián)系統(tǒng)。通過調(diào)整鄰羧基部分的親核性，實(shí)現(xiàn)了一種稱為“堅(jiān)定推動(dòng)打開和光推動(dòng)鎖定”的電子效應(yīng)，這使得探針在感應(yīng)之前能夠完全螺旋環(huán)化，并且當(dāng)輕推動(dòng)苯胺氨基甲酸酯觸發(fā)器轉(zhuǎn)化為堅(jiān)定推動(dòng)的苯胺時(shí)，可以有效地形成兩性離子。該平臺(tái)在活小鼠中產(chǎn)生具有~50倍熒光和可激活光聲信號(hào)的雙模態(tài)NIR-II成像探針，超過了已報(bào)道的可激活信號(hào)通常低于10倍的探針。為了證明通用性，成功地設(shè)計(jì)了用于過氧化氫（H2O2）和硫化氫（H2S）的探針。本文設(shè)想廣泛采用化學(xué)平臺(tái)，在各種應(yīng)用中設(shè)計(jì)可激活的NIR-II探針。

 

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圖1. 熒光調(diào)諧策略

 

本文探討了各種鄰羧基團(tuán)如何影響一對(duì)CS NIR衍生物的平衡：一個(gè)具有NHBoc，另一個(gè)具有NH2取代基位于熒光團(tuán)的 C5 位置，模擬基于反應(yīng)的探針在感應(yīng)其生物靶標(biāo)之前和之后的行為（圖 1B）。我們的研究揭示了C5取代基的供電子能力與鄰羧基部分的親核性之間的協(xié)同作用。這導(dǎo)致了理想匹配的電子效應(yīng)的鑒定，本文稱之為“穩(wěn)定的開啟和光推鎖定”（FOLL），表示 NHBoc 取代基誘導(dǎo)的螺旋環(huán)化在感應(yīng)和 NH2 之前感應(yīng)后的取代基誘導(dǎo)兩性離子，假設(shè)理想匹配的鄰羧基部分已經(jīng)到位。通過FOLL，在基于溶液和細(xì)胞的成像實(shí)驗(yàn)中觀察到~50倍的熒光響應(yīng)。

將FOLL效應(yīng)轉(zhuǎn)化為優(yōu)化的羅丹明雜交體，其最大發(fā)射波長(zhǎng)（920 nm）落入NIR-II窗口，本文建立了一個(gè)通用化學(xué)平臺(tái)，用于在活小鼠（SBR~50）中設(shè)計(jì)具有最小背景和超熒光信號(hào)的NIR-II探針。此外，該化學(xué)平臺(tái)中的這種螺旋環(huán)化-兩性離子平衡機(jī)制促進(jìn)了其在可激活光聲成像中的應(yīng)用。作為驗(yàn)證，作者成功開發(fā)了使用此平臺(tái)進(jìn)行探測(cè)H2O2的探針。這使得內(nèi)源性H2O2的熒光和可激活光聲成像成為可能�；罴�(xì)胞和活小鼠的背景信號(hào)幾乎為零，證明了該平臺(tái)的可靠性。該平臺(tái)的潛在通用性也體現(xiàn)在成功構(gòu)建 H2S 探針。

圖2. 調(diào)整鄰羧基部分以獲得有效的 FOLL 效果

 

本文使用 CS NIR 熒光團(tuán)作為模型開始研究，因?yàn)樗�易于合成。鑒于分析物觸發(fā)的從苯基氨基甲酸酯到苯胺的轉(zhuǎn)化在檢測(cè)酶活性、反應(yīng)性代謝物或金屬離子方面的廣泛適用性，作者戰(zhàn)略性地將兩種取代基引入熒光團(tuán)的 C5 位置：無電子供體 NHBoc 基團(tuán)和提供 NH2 的電子組（圖 2A）。該做法的目標(biāo)有兩個(gè)：（i）模擬探針在感測(cè)目標(biāo)之前和之后的結(jié)構(gòu)變化，以及（ii）模擬熒光團(tuán)核心在感應(yīng)前后的不同親電性。目標(biāo)是確定一種鄰位羧基部分，該部分有利于 NHBoc 取代結(jié)構(gòu)的最大螺旋環(huán)化（“輕推鎖定”效應(yīng)）和 NH2- 的最大兩性離子形成替代對(duì)應(yīng)物（“堅(jiān)定推動(dòng)打開”效應(yīng)）。

作者最初合成了以羧酸為鄰羧基部分的 C1 化合物（圖 2B）。熒光光譜測(cè)量顯示，NHBoc-C1在近紅外范圍內(nèi)有中等背景信號(hào)，表明螺旋環(huán)化效率低下，其在該范圍內(nèi)的顯著吸收進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)。這與羧酸有限的親核性一致。為了增強(qiáng)螺環(huán)化傾向，將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為親核性更強(qiáng)的N-甲基酰胺。雖然這種轉(zhuǎn)變完全消除了 NHBoc-C2 近紅外范圍內(nèi)的背景熒光，但它阻礙了 NH2- 中兩性離子的形成由于N-甲基酰胺的高親核性而取代的對(duì)應(yīng)物（圖2C）。

然后，通過降低氮原子的電子密度或增加其周圍的空間效應(yīng)來微調(diào)酰胺基團(tuán)的親核性。這導(dǎo)致了另外七對(duì)化合物（C3至C9）的合成，并記錄了它們的熒光光譜（圖2，D至J）。由于傳統(tǒng)羅丹明的螺環(huán)化-兩性離子平衡對(duì)pH變化敏感，我們使用pH 7.4下NH2/NHBoc對(duì)的近紅外吸收強(qiáng)度比作為兩性和螺環(huán)形式之間探針平衡變化的粗略估計(jì)（圖2K和圖S15），并通過高斯計(jì)算將這些數(shù)據(jù)與酰胺氮原子的計(jì)算電子密度相關(guān)聯(lián)（圖S16和表S2）（48），間接測(cè)量了親核性。如圖2K所示，具有最低和最高親核性的羧基團(tuán)都具有較低的信噪比。由于螺旋環(huán)化有限，較差的親核試劑無法有效抑制NHBoc取代結(jié)構(gòu)中的背景信號(hào)，而強(qiáng)親核試劑無法在NH2-中實(shí)現(xiàn)靈敏的熒光信號(hào)由于兩性離子形成有限而取代的結(jié)構(gòu)。在測(cè)試的化合物中，C5對(duì)具有鄰羧基部分作為�；�磺酰胺的C5對(duì)表現(xiàn)出最明顯的可激活熒光（圖2L），NH2與NHBoc-C5相比，-C5的量子產(chǎn)率增加了7倍。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 FOLL 效應(yīng)誘導(dǎo)的高 SBR 的功效，作者用三對(duì)化合物（C2、C5 和 C6）對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，其中 NHBoc 取代的化合物代表感應(yīng)前的探針，而 NH2-取代化合物代表感應(yīng)后的探針。用 C6 對(duì)結(jié)構(gòu)染色的細(xì)胞表現(xiàn)出均勻的強(qiáng)熒光，與 NHBoc-C6 相比，僅觀察到 NH 2-C6的 1.5 倍信號(hào)適度增加。相反，用C2對(duì)化合物染色的細(xì)胞保持非熒光，與光譜測(cè)量一致。正如預(yù)期的那樣，用 C5 對(duì)化合物染色的細(xì)胞表現(xiàn)出異常的熒光反應(yīng)，NHBoc-C5 顯示幾乎為零的背景信號(hào)和 NH2-C5 表現(xiàn)出明顯的熒光（~50 倍）（圖 2、M 和 N ）。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了作者的FOLL策略在設(shè)計(jì)高熒光探針方面的成功。

在確定了合適的鄰羧基團(tuán)后，我們的下一個(gè)目標(biāo)是優(yōu)化羅丹明雜化聚甲基染料的熒光特性。我們的策略包括探索硫取代和共軛延伸，以設(shè)計(jì)具有NIR-II發(fā)射的熒光團(tuán)。我們?cè)O(shè)計(jì)了四種結(jié)構(gòu)，并通過Knoevenagel反應(yīng)合成了它們（圖3A）。在檢查它們的吸收、熒光和光聲光譜（圖3，B至I）后，很明顯，D4表現(xiàn)出最多的紅移吸收、發(fā)射和光聲信號(hào)。D4 表現(xiàn)出超出 900 nm 范圍的尾狀吸收和巨大的光聲強(qiáng)度。鑒于 D4 在 C5 位置具有羥基取代基，選擇D4作為候選熒光團(tuán)，用于構(gòu)建用于設(shè)計(jì)熒光探針的通用化學(xué)平臺(tái)。

圖3. 調(diào)整羅丹明雜化聚亞甲基染料的NIR-II發(fā)射

 

作者的下一步是評(píng)估 C5 中酰基磺酰胺的親核性與苯胺衍生的 D4 熒光團(tuán)的相容性。合成了化合物 NHBoc-D4 和 NH2-D4，摻入鄰�；�磺酰胺部分（圖4A）。通過比較這對(duì)化合物的吸收和熒光光譜，我們發(fā)現(xiàn)FOLL效應(yīng)在該熒光基團(tuán)中表現(xiàn)出比CS NIR熒光團(tuán)更大的功效。如圖4（B和C）所示，NHBoc-D4在近紅外范圍內(nèi)的吸收和發(fā)射幾乎為零，而NH2-D4 在此范圍內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收和熒光。

作者進(jìn)一步驗(yàn)證了這對(duì)結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞和活小鼠中的顯著成像對(duì)比度。用 NHBoc-D4 染色的細(xì)胞沒有可見熒光，而用 NH2-D4 染色的細(xì)胞顯示明顯的熒光;并觀察到~28倍的熒光信號(hào)（圖4，D和E）。同樣，在將探針注射到活小鼠腫瘤中后，在 NHBoc-D4 組中沒有觀察到信號(hào)，而 NH2-D4組表現(xiàn)出明顯的信號(hào)（~50倍）（圖4，F(xiàn)和G）。作者觀察到，在靜脈給藥時(shí)，NH2-D4 顯示全身分布曲線。在處死小鼠并使用NIR-II成像系統(tǒng)檢查各種器官后，在NHBoc-D4組的器官中未檢測(cè)到可辨別的熒光信號(hào)。相比之下，來自 NH 2-D4的所有器官組表現(xiàn)出明顯的信號(hào)，其中肝臟的信號(hào)最為突出。兩組之間的對(duì)比在不同器官中有所不同，這歸因于探針的局部濃度不同。

鑒于 NHBoc-D4 和 NH 之間的近紅外吸收形成鮮明對(duì)比2-D4，在腫瘤內(nèi)施用探針時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行了光聲掃描。橫截面圖像顯示NHBoc-D4組沒有信號(hào)，而NH2-D4組表現(xiàn)出明顯的信號(hào)（~50倍）（圖4，H和I），與熒光成像觀察到的結(jié)果一致。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，NH2-D4應(yīng)通過轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基甲酸酯，成為構(gòu)建高熒光NIR-II探針的理想化學(xué)平臺(tái)。此外，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)可激活的光聲成像。值得注意的是，在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中100μM的NH2-D4對(duì)20當(dāng)量的高氧化物種如ONOO-和NaClO的處理是穩(wěn)定的。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了這種化學(xué)平臺(tái)在廣泛的生物應(yīng)用中的多功能性和潛力。

圖4. 開發(fā)用于熒光NIR-II成像的化學(xué)平臺(tái)

 

苯硼酸酯部分作為感測(cè)H2O2的化學(xué)觸發(fā)器有著悠久的歷史。因此，我們將NH2-D4熒光團(tuán)轉(zhuǎn)化為硼苯氧基氨基甲酸酯。該探針被標(biāo)記為H2O2-D4（圖5A），測(cè)試了其對(duì)H2O2的反應(yīng)。H2O2-D4顯示出以500nm為中心的最大吸收帶，表明其以螺環(huán)形式存在。與H2O2相互作用后，以500nm為主的吸光度降低，同時(shí)出現(xiàn)了以790和900nm為中心的兩個(gè)相鄰峰（圖5B）。這一轉(zhuǎn)變表明H2O2觸發(fā)了兩性離子的形成。值得注意的是，吸光度的減少和增加都與施加的H2O2劑量成正比（圖5C）。動(dòng)態(tài)記錄表明，H2O2與H2O2-D4的傳感在1小時(shí)內(nèi)完成（圖5C）。液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果（圖5E），顯示H2O2-D4在與H2O2相互作用1小時(shí)內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為NH2-D4。在不同的生物相關(guān)pH水平下進(jìn)行了傳感反應(yīng)（圖5F）。觀察到探針在測(cè)試的pH值水平下保持黑暗。然而，H2O2相互作用后的傳感信號(hào)隨著pH值的增加而增強(qiáng)。由于我們已經(jīng)證實(shí)NH2-D4的螺環(huán)化兩性離子平衡對(duì)pH不敏感，這一觀察結(jié)果歸因于在更堿性的條件下，探針更有效地轉(zhuǎn)化為NH2-D4，這是由H2O2的反應(yīng)性增強(qiáng)和自焚連接體的加速切割共同驅(qū)動(dòng)的。此外，證實(shí)了探針對(duì)H2O2的高選擇性，因?yàn)槠渌�反�?yīng)性物質(zhì)對(duì)其吸收幾乎沒有變化（圖5D）。同樣，在與H2O2相互作用時(shí)，觀察到探針的高度熒光反應(yīng)（圖5，G和H）。值得注意的是，由于螺環(huán)化在NIR-II區(qū)域誘導(dǎo)了有效的熒光淬滅，通過補(bǔ)充材料中詳述的3SB/K方法，H2O2-D4可以實(shí)現(xiàn)7.0 nM的H2O2檢測(cè)限。

圖5. H2O2型可激活探針驗(yàn)證研究

 

在成功評(píng)估了探針在基于水溶液的測(cè)定中對(duì) H2O2 的性能，并確認(rèn)了其在培養(yǎng)細(xì)胞（圖S28）和小鼠（圖 S29）中的安全性之后，我們的下一步是使用該探針對(duì)生物樣品中的H2O2 進(jìn)行成像。我們首先用不同濃度的H2O2 刺激培養(yǎng)細(xì)胞 3 小時(shí)，以誘導(dǎo)急性氧化應(yīng)激。隨后，清洗細(xì)胞，用 H2O2-D4 染色，然后進(jìn)行成像。觀察到細(xì)胞熒光隨著 H2O2濃度的變化而呈劑量依賴性增加（圖 6、A 和 B）。值得注意的是，與陰性對(duì)照組相比，在存在 H2O2（1.0 mM）的情況下，細(xì)胞探針熒光增加了約 15 倍。將研究擴(kuò)展到另一種涉及百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激的模型。在這種設(shè)置中，細(xì)胞最初用不同濃度的百草枯處理 3 小時(shí)，然后清洗、用探針染色，然后成像。與 H2O2處理組類似，我們觀察到細(xì)胞探針熒光隨著百草枯濃度的變化而呈劑量依賴性增加（圖 6、C 和 D）。總的來說，這些結(jié)果表明 H2O2-D4能夠通過其熒光信號(hào)評(píng)估細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的程度，從而為監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)提供了有價(jià)值的工具。

圖6. 活細(xì)胞和小鼠中的 H2O2 可激活成像

 

基于細(xì)胞研究中獲得的有希望的結(jié)果，我們繼續(xù)評(píng)估H2O2-D4在異種移植4T1腫瘤小鼠模型中成像H2O2的可行性。然后，進(jìn)行實(shí)時(shí)NIR-II熒光成像，以監(jiān)測(cè)和量化活體小鼠腫瘤內(nèi)注射探針后H2O2激活探針熒光信號(hào)的增強(qiáng)（圖6E）。記錄7小時(shí)后，腫瘤部位的NIR-II熒光大約比背景高50倍（圖6F），這代表了有史以來最高的SBR。此外，作者還探討了該探針在H2O2可激活光聲成像中的適用性。與NIR-II熒光成像結(jié)果類似，觀察到小鼠腫瘤部位光聲信號(hào)隨時(shí)間增加，幾乎沒有背景信號(hào)干擾，8小時(shí)后SBR達(dá)到50（圖6，G和H）。

受H2O2-D4成功應(yīng)用的鼓舞，我們開始探索設(shè)計(jì)可激活NIR-II探針的化學(xué)平臺(tái)的普遍適用性。其中一個(gè)重要的目標(biāo)分子是H2S，它是生命系統(tǒng)中的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，在多種生理過程中起著關(guān)鍵作用。通過將H2S響應(yīng)觸發(fā)器引入NH2-D4熒光團(tuán)，開發(fā)了H2S傳感探針，表示為H2S-D4（圖7A）。

作者的初步研究旨在評(píng)估探針對(duì)水溶液中H2S的傳感性能。吸收光譜顯示，H2S-D4在近紅外范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出明顯的吸收（圖7B），表明更傾向于螺環(huán)形式。然而，在暴露于H2S后，作者觀察到近紅外吸收的劑量依賴性增強(qiáng)，表明向兩性離子形式的轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變也被發(fā)現(xiàn)與孵育時(shí)間有關(guān)（圖7C）。此外，作者證實(shí)了探針對(duì)H2S的高選擇性（圖7D），與報(bào)道的苯基疊氮化物部分對(duì)H2S的選擇性一致。與吸收分析平行，熒光光譜測(cè)量表明探針對(duì)H2S有顯著的熒光反應(yīng)（圖7E），檢測(cè)限確定為23 nM。使用了高效液相色譜（HPLC）分析，為H2S觸發(fā)的氨基甲酸酯探針轉(zhuǎn)化為NH2-D4熒光團(tuán)（圖7F和）。

細(xì)胞首先用NaHS（1 mM）作為H2S供體處理3小時(shí)，進(jìn)行H2S-D4染色（5μM）不同時(shí)間，然后成像。結(jié)果顯示，染色時(shí)間依賴性細(xì)胞探針熒光增強(qiáng)（圖7、G和H），表明細(xì)胞H2S-D4持續(xù)轉(zhuǎn)化為NH2-D4。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用不同劑量的NaHS（0、0.5和1 mM）處理3小時(shí)，然后用H2S-D4孵育90分鐘，然后成像。細(xì)胞探針熒光信號(hào)以NaHS劑量依賴的方式增強(qiáng)，表明其能夠?qū)�活�?xì)胞中不同的H2S濃度做出反應(yīng)（圖7、I和J）。這一結(jié)果表明，探針H2S-D4對(duì)內(nèi)源性H2S生成的成像足夠敏感。

圖7. 用于成像H2S的可激活探針

 

本文通過結(jié)合分析物觸發(fā)的電子效應(yīng)與鄰羧基部分的親核性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。使用羅丹明雜交物作為模型化合物，使用 5-NHBoc 取代的衍生物在感應(yīng)生物靶標(biāo)之前模擬探針，使用 5-NH2–感應(yīng)后代表產(chǎn)品的替代對(duì)應(yīng)物。通過仔細(xì)調(diào)整正羧基部分，確定了一種理想匹配的電子效應(yīng)——用力推動(dòng)打開，輕推鎖定。這種效應(yīng)確保了探針在感應(yīng)前的最佳螺旋環(huán)化和感應(yīng)后的最大兩性離子特性。

此外，通過結(jié)構(gòu)改性來改進(jìn)混合物的發(fā)射特性，我們確定了NH2-D4 作為具有 NIR-II 區(qū)域發(fā)射能力的熒光團(tuán)。選定的鄰羧基團(tuán)完美地補(bǔ)充了該熒光團(tuán)。雖然 NHBoc-D4 表現(xiàn)出可忽略不計(jì)的 NIR 吸收，這意味著完全螺旋環(huán)化，但 NH2-D4顯示出大量的近紅外吸收率。小鼠活體成像證實(shí)了NH2-D4與 NHBoc-D4 相比的高熒光和可激活光聲信號(hào)。

最后，驗(yàn)證了 NH2-D4 熒光團(tuán)作為 NIR-II 范圍內(nèi)可激活光學(xué)探針的直接設(shè)計(jì)的化學(xué)平臺(tái)的適用性和通用性。我們通過將 NH2-D4 中的胺基簡(jiǎn)單地衍生為相應(yīng)的 H2O2或 H2S 響應(yīng)氨基甲酸酯，成功開發(fā)了超靈敏的熒光 NIR-II 探針。還發(fā)現(xiàn)這些探針與可激活光聲成像兼容。此外，還實(shí)現(xiàn)了小鼠腫瘤組織或受損肝臟的活體成像。因此，該平臺(tái)代表了一種設(shè)計(jì)可激活 NIR-II 探針的直接方法，可在 NIR-II 光譜中實(shí)現(xiàn)雙模態(tài)成像。

 

參考文獻(xiàn)

Lili Shen et al., A firm-push-to-open and light-push-to-lock strategy for a general chemical platform to develop activatable dual-modality NIR-II probes. Sci. Adv.10,eado2037 (2024).

 

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