什么是過(guò)敏性疾�。�
過(guò)敏性疾病，也被稱為變態(tài)反應(yīng)性疾病，是由人體免疫系統(tǒng)對(duì)某些外界物質(zhì)產(chǎn)生異常反應(yīng)而引起的一類疾病。當(dāng)人接觸到過(guò)敏原時(shí)，會(huì)在血液中產(chǎn)生一種特異性免疫球蛋白E抗體（IgE），對(duì)某種特定的過(guò)敏原產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。過(guò)敏性疾病的發(fā)生具有遺傳傾向，且近年來(lái)患病率呈上升趨勢(shì)。
 
過(guò)敏性疾病根據(jù)病因，可分為以下幾類：
1.呼吸道過(guò)敏性疾�。哼^(guò)敏性咽炎、過(guò)敏性鼻炎、哮喘等；
2.皮膚過(guò)敏性疾�。菏n麻疹、濕疹、藥疹、接觸性皮炎等；
3.消化道過(guò)敏性疾�。菏澄锏鞍渍T導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎綜合征、食物蛋白誘導(dǎo)的腸病等；
4.眼部過(guò)敏性疾�。哼^(guò)敏性結(jié)膜炎；
5.全身系統(tǒng)性過(guò)敏性疾病：過(guò)敏性休克、過(guò)敏性紫癜等。
 
長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)：助力解鎖過(guò)敏性疾病研究
納米孔測(cè)序等長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)以其超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)和直接檢測(cè)堿基甲基化修飾等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。這項(xiàng)技術(shù)能夠完整組裝拼接物種全基因組，發(fā)現(xiàn)新的過(guò)敏源，并且能深入分析個(gè)體的基因組，識(shí)別與過(guò)敏性疾病相關(guān)的遺傳變異，為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。
 
1、塵螨Dermatophagoides farinae染色體級(jí)別基因組和轉(zhuǎn)錄組組裝揭示兩種新過(guò)敏原Der f 37和Der f 39
 
塵螨（HDMs），特別是Dermatophagoides pteronyssinus（Der p）、Dermatophagoides farinae（Der f），是吸入性過(guò)敏原的主要來(lái)源。需要深入分析HDM過(guò)敏原的全譜，以闡明HDM過(guò)敏機(jī)制并指導(dǎo)診斷和免疫治療的發(fā)展。
準(zhǔn)確的塵螨（HDM）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將促進(jìn)我們對(duì)HDM過(guò)敏原的理解。本研究旨在通過(guò)進(jìn)行塵螨（Dermatophagoides farinae）的染色體級(jí)基因組組裝和精確的轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定新的過(guò)敏原。在本研究中，從HDM蟲(chóng)體和卵中提取遺傳物質(zhì)，使用下一代測(cè)序（NGS）的短讀長(zhǎng)序列和PacBio/Nanopore測(cè)序的長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列來(lái)構(gòu)建D. farinae的核基因組、轉(zhuǎn)錄組和線粒體基因組。通過(guò)與WHO/IUIS過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出候選同源物。
結(jié)果顯示，與D. farinae草圖基因組相比，本研究中獲得的測(cè)序讀段中來(lái)源于細(xì)菌DNA的占比大幅降低（從22.9888%降至1.5585%），基因組大小得到校正（從53.55 Mb增至58.77 Mb），并且組裝獲得的連續(xù)片段（contig）N50增加（從8.54 kb增至9365.49 kb）。組裝的基因組包含10個(gè)contig，極低的微生物污染，鑒定得到33個(gè)典型過(guò)敏原和2個(gè)新的過(guò)敏原�？寺×�8個(gè)同源性≥50%的同源物，其中2個(gè)與HDM過(guò)敏血清結(jié)合，被鑒定為過(guò)敏原（Der f 37和Der f 39）。綜上，本研究獲得了D. farinae的染色體級(jí)基因組、轉(zhuǎn)錄組和線粒體基因組，能夠支持過(guò)敏原鑒定和診斷及免疫治療疫苗的開(kāi)發(fā)。
 
Fig.1 Chromsome-level assembly of genome and mitochondrion genome of D. farinae and identification of novel HDM allergens Der f 37 and Der f 39. A. Genome assembly showing locations of allergen genes. B. Mitochondrial genome of D. farinae. Mite allergens based on WHO/IUIS allergen nomenclature (http://www.allergen.org/search.php?TaxSource¼Animalia%20Arthropoda). Der f 17 sequence information: not available; HDM allergen Groups 12 and 19: not found; Der p 38 homolog in D. farinae (bacterial lytic enzyme like protein, GenBank accession No. MT360919.1) showed no IgE-binding activity in this study. C. IgE binding activity determined by IgE-western blots of rDsbA-Der f 37 with individual sera from 192 HDM-allergic patients and 20 healthy non-allergic individuals. D. Western blot assay identifying rDer f 37 protein binding by IgE in sera from 10 patients with HDM allergies (left) and 10 non-HDM allergic subjects (control, right). E. IgE binding activity determined by IgE-ELISA of rDer f 39 with individual sera from 76 HDM-allergic patients and 20 healthy nonallergic individuals. F. Western blot assay identifying rDer f 39 protein binding by IgE in sera from 7 patients with HDM allergies (left) and 10 non-allergic subjects (control, right). The HDM-specific IgEs (>100 kUA/L) within the sera samples were evaluated using an ImmunoCAP system.
 
使用Nanopore測(cè)序技術(shù)，除了Contig2外，所有contig都超過(guò)了2Mb，最長(zhǎng)的一個(gè)超過(guò)了13Mb，表明組裝質(zhì)量達(dá)到了接近染色體級(jí)別。本研究注釋了組裝基因組中的33個(gè)典型過(guò)敏原基因，包括2個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，即Der f 37和Der f 39，并確定了它們?cè)谙鄳?yīng)contig中的位置。為了獲得高質(zhì)量的基因集，我們對(duì)染色體級(jí)組裝結(jié)果進(jìn)行了同源性分析、下一代RNA測(cè)序（RNA-seq）和基因組從頭注釋。研究者鑒定了10,684個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，并通過(guò)NCBI非冗余蛋白、SwissProt和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)超過(guò)91.67%的基因進(jìn)行了功能注釋。
 
在這項(xiàng)研究中，納米孔測(cè)序技術(shù)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它通過(guò)提供長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列數(shù)據(jù)，幫助研究者實(shí)現(xiàn)了對(duì)塵螨Dermatophagoides farinae基因組的染色體級(jí)別組裝。這種長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)顯著減少了組裝過(guò)程中的缺失，提高了基因組的連續(xù)性和準(zhǔn)確性，從而使得基因組大小的校正、組裝序列N50的顯著提升以及基因組中過(guò)敏原的精確鑒定成為可能。此外，納米孔測(cè)序技術(shù)還有助于減少細(xì)菌DNA的污染，這對(duì)于提高基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量至關(guān)重要，進(jìn)而支持了過(guò)敏原的識(shí)別和診斷及免疫治療疫苗的開(kāi)發(fā)。

2、美洲大蠊基因組組裝和注釋揭示全面的蟑螂過(guò)敏原譜
 
美洲大蠊是城市地區(qū)最常見(jiàn)的蟑螂類型之一，已被報(bào)道有增加過(guò)敏和哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。由于缺乏基因組相關(guān)信息，這一物種中只鑒定出了有限的過(guò)敏原組（Per a 1–13）。
為了擴(kuò)展美洲大蠊的過(guò)敏原譜，研究團(tuán)隊(duì)采用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組方法，基于蛋白質(zhì)同源性鑒定了潛在過(guò)敏原，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）在對(duì)美洲大蠊過(guò)敏的泰國(guó)患者中進(jìn)行了測(cè)試。
研究結(jié)果表明，成功組裝了染色體級(jí)別的美洲大蠊基因組（3.06 Gb），并顯著提高了其連續(xù)性（N50 = 151 Mb）。鑒定了七組新的過(guò)敏原組，包括烯醇化酶（Per a 14）、細(xì)胞色素C（Per a 15）、絲束蛋白（Per a 16）、α-微管蛋白（Per a 17）、環(huán)肽（Per a 18）、孔蛋白3（Per a 19）和過(guò)氧化物酶6（Per a 20），并在Per a 7中鑒定了一個(gè)新的同種型變體（Per a 7.02）。此外，通過(guò)比較分析，揭示了與近緣的蜚蠊目物種之間可能存在的交叉反應(yīng)性。
 
Our high-quality genome (3.06 Gb) and precisely annotated proteome (29,939) of the American cockroach help revealed a broader allergen spectrum. Seven novel allergen groups Per a 14 to Per a 20 and one isoallergens (Per a 7.02) were validated using ELISA in Thai cohort.
Comparative analysis of P. americana with the closely related Blattodea species revealed the possibility of cross-reaction.
Abbreviations: ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; gDNA, genomic DNA; 
GST, glutathione S-transferases; SPT, skin prick test; MS, mass spectrometry
 
在這項(xiàng)研究中，納米孔測(cè)序技術(shù)提供了長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列數(shù)據(jù)，有助于提升基因組組裝的質(zhì)量，尤其是在解決基因組中的重復(fù)區(qū)域和復(fù)雜結(jié)構(gòu)方面。通過(guò)與Illumina高通量測(cè)序和Hi-C技術(shù)相結(jié)合，納米孔測(cè)序技術(shù)使得研究者能夠構(gòu)建出一個(gè)更高連續(xù)性的基因組，這對(duì)于后續(xù)的過(guò)敏原發(fā)現(xiàn)和表征至關(guān)重要。這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解蟑螂引起的過(guò)敏疾病、開(kāi)發(fā)新的診斷方法和特異性免疫療法具有重要意義。

3、RNA測(cè)序在乳糜瀉研究中的應(yīng)用綜述
 
近幾十年來(lái)，RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，成為轉(zhuǎn)錄組分析的關(guān)鍵技術(shù)。從常規(guī)細(xì)胞群體測(cè)序（bulk sequencing）向單細(xì)胞和空間方法的轉(zhuǎn)變，將研究的精確度提高到了細(xì)胞層面，為理解個(gè)體免疫細(xì)胞及自身免疫病發(fā)展的分子機(jī)制提供了寶貴信息。在乳糜瀉（CeD）等自身免疫疾病研究中，RNA-seq技術(shù)尤為關(guān)鍵，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組比較、營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)、小麥研究、CeD背景下的癌癥研究、基因與非編碼RNA介導(dǎo)的表觀遺傳研究、疾病監(jiān)測(cè)與生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、線粒體功能調(diào)控、治療靶點(diǎn)識(shí)別和藥物作用機(jī)制等多個(gè)領(lǐng)域。
 
長(zhǎng)讀長(zhǎng)cDNA測(cè)序和直接RNA-seq能提供更全面的亞型水平數(shù)據(jù)，尤其擅長(zhǎng)識(shí)別短讀長(zhǎng)方法難以檢測(cè)的亞型，在該研究領(lǐng)域正逐漸取代短讀長(zhǎng)測(cè)序。相對(duì)于使用傳統(tǒng)NGS短讀長(zhǎng)測(cè)序面臨的挑戰(zhàn)，基于PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)為研究麩質(zhì)蛋白基因提供了解決方案，能夠精確獲取mRNA完整序列信息，結(jié)合RNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和高級(jí)生物信息學(xué)工具，可更深入了解復(fù)雜麩質(zhì)蛋白及面包小麥中的乳糜瀉表位，促進(jìn)麩質(zhì)蛋白作用研究并支持更健康小麥品種的開(kāi)發(fā)。
 
 
長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在過(guò)敏性疾病研究的未來(lái)展望
長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)因其明顯的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，在過(guò)敏性疾病的研究中具有很大的應(yīng)用潛力：

• 基因組變異檢測(cè)：長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)到基因組中的結(jié)構(gòu)變異，包括插入、缺失、倒位和復(fù)制等，這些變異可能與過(guò)敏性疾病的發(fā)生有關(guān)。
• 免疫組庫(kù)分析：過(guò)敏性疾病與免疫系統(tǒng)的反應(yīng)密切相關(guān)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可以用于免疫組庫(kù)的分析，幫助研究B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的多樣性，進(jìn)而了解免疫應(yīng)答的復(fù)雜性。
• 微生物組分析：腸道微生物組與過(guò)敏性疾病有關(guān)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序有助于解析微生物群落的組成和功能，為研究過(guò)敏性疾病的微生物組基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支持。
• 表觀遺傳學(xué)研究：DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能影響過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)能夠直接檢測(cè)這些修飾，有助于揭示表觀遺傳在過(guò)敏性疾病中的作用。
• 快速病原體檢測(cè)：對(duì)于由病原體引起的過(guò)敏性疾病，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)可以快速識(shí)別病原體的基因組序列，有助于病原體的鑒定和疫情監(jiān)控。
• 藥物基因組學(xué)研究：長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)有助于研究藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)的基因多態(tài)性，為過(guò)敏性疾病的個(gè)體化治療提供信息。
• 疾病機(jī)理研究：長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)可以揭示過(guò)敏性疾病相關(guān)的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增進(jìn)對(duì)疾病機(jī)理的理解。
• 個(gè)性化醫(yī)療：通過(guò)長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，可以為過(guò)敏性疾病患者提供更精準(zhǔn)的基因組信息，有助于開(kāi)發(fā)個(gè)性化的預(yù)防、診斷和治療方案。

過(guò)敏性疾病雖然普遍，但并非不可戰(zhàn)勝。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，納米孔測(cè)序等長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在過(guò)敏性疾病研究中的應(yīng)用前景廣闊。期待未來(lái)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)能助力醫(yī)學(xué)科研工作者解鎖更多的過(guò)敏性疾病機(jī)制、深入理解過(guò)敏性疾病的遺傳機(jī)制，為患者帶來(lái)更精準(zhǔn)的治療方案。
 
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