本文要點：在近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-3000 nm）發(fā)射的熒光染料為血管和淋巴系統(tǒng)的實時和高分辨率成像提供了重大進展。然而，在體內(nèi)NIR-II追蹤標記細胞的課題仍然具有挑戰(zhàn)性。在這里，我們開發(fā)了一種屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）NIR-II熒光團（FE-4ZW），帶有兩性離子末端基團，用于高效細胞標記，而無需使用細胞穿透肽，從而增強了細胞遷移位置的非侵入性體內(nèi)測定。拴系末端磺基銨內(nèi)鹽具有對細胞膜的高親和力，因此即使對于固定細胞也能實現(xiàn)穩(wěn)定的標記。移植干細胞的命運和腫瘤細胞在腦或外周組織中沿淋巴系統(tǒng)的遷移由細胞內(nèi)化的FE-4ZW清楚地監(jiān)測。本文還證實，臨床使用的表面活性劑D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以減少肝臟和脾臟對FE-4ZW的攝取。本文報道的熒光團設(shè)計策略和細胞標記技術(shù)為細胞遷移的可視化和對重新定位過程的洞察開辟了一個新的領(lǐng)域，從而最終為更詳細地研究干細胞治療和腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機制提供了機會。

 

 

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方案1. FE-4ZW作為細胞示蹤劑的制造和體內(nèi)跟蹤血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)中細胞遷移的圖示

 

本文利用具有 S-D-A-D-S 骨架的成熟小分子核心結(jié)構(gòu)來開發(fā) NIR-II 熒光團，該熒光團可以很容易地與細胞壁和隔室的脂質(zhì)單層/雙層相互作用。同時，系統(tǒng)地篩選了不同的末端組（兩性離子和非兩性離子），這些末端組被拴在NIR-II熒光核心的外圍屏蔽單元上（方案1A）。最終，這種篩選方法能夠開發(fā)出具有兩性離子基團的可滲透NIR-II熒光團（FE-4ZW），從而提供高效的體內(nèi)細胞跟蹤（方案1B）。更具體地說，其兩性離子磺基團的合理分子結(jié)構(gòu)設(shè)計為我們提供了用于細胞動力學(xué)研究的理想細胞跟蹤探針。標記細胞（神經(jīng)干細胞 [NSC] 和腫瘤細胞）的遷移和生物分布在 NIR-II 成像窗口中以非侵入性方式可視化，這賦予了高時間和空間分辨率。重要的是，跟蹤器幫助我們實現(xiàn)了腦腫瘤細胞通過淋巴系統(tǒng)和MLV轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié)的實時成像。觀察到FE-4ZW內(nèi)化的主動和被動細胞轉(zhuǎn)運途徑。展示的FE-4ZW NIR-II染料為獲得基于小有機NIR-II熒光團的天然滲透性細胞造影劑提供了方便的合成方向，并為研究人員提供了非侵入性監(jiān)測標記細胞的命運和更好地了解細胞水平疾病進展的潛在機會。

本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在單獨靜脈給藥后的體內(nèi)藥代動力學(xué)。與循環(huán)時間長且具有部分腎排泄特征的FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW在短血循環(huán)時間（∼50分鐘）內(nèi)在肝臟和脾臟中積累更快。隨后，肝臟和脾臟中的熒光信號強度隨著時間的推移而增加，逐漸降低（圖1A-C和S13）�；�于FE-4ZW與FE-2PEG相比更快的肝臟攝取特征，我們假設(shè)當FE-4ZW注射到小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中時，它們也被肝細胞和/或巨噬細胞（Kupffer細胞）內(nèi)吞。這種發(fā)現(xiàn)的差異初步表明，與FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW具有更快的積累速率，從而表明FE-4ZW可能與細胞膜具有更強的相互作用，因此有可能作為更好的細胞造影劑。因此，我們設(shè)計了廣泛的體外和/或體內(nèi)實驗來測量FE-4ZW作為細胞造影劑的能力。

圖1. FE熒光團提供有效的第二近紅外（NIR-II）熒光成像對比度水平的能力

 

由于FE-4ZW與細胞膜之間存在潛在的相互作用和/或親和力，我們的方案不要求使用CPP，因此在獲得熒光細胞方面更加簡化和直接（圖1D-F）。利用幾種類型的細胞系，包括肝臟、巨噬細胞、干細胞和腫瘤細胞來評估 FE 熒光團系列。在FE-4ZW與不同細胞系共孵育的整個過程中，F(xiàn)E-4ZW標記細胞的NIR-II熒光強度隨時間增加，其中在12小時時間點有足夠的標記密度允許明亮的NIR-II成像（圖1F和S5）。對于所有測試的細胞系，F(xiàn)E-4ZW的明亮NIR-II熒光信號允許在內(nèi)化時明確地勾勒出細胞形狀（圖1E，F(xiàn)和S5）。

圖2. FE-4ZW作為一種高性能細胞標記染料

 

相比之下，在 L-O2 細胞組中，當它們與 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 熒光團一起孵育時，獲得了非常低的熒光強度。這些結(jié)果表明，分子結(jié)構(gòu)在作為高效細胞標記生物技術(shù)的作用中起著重要作用（圖2A，B）。FE-4ZW的細胞內(nèi)光穩(wěn)定性也是通過將標記的L-O2細胞置于連續(xù)激光照射下來確定的（圖2C）。熒光信號僅在2小時的時間過程中以極慢的速率衰減。總的來說，F(xiàn)E-4ZW是一種理想的細胞成像劑，具有明亮的細胞內(nèi)NIR-II熒光發(fā)射和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。FE-4ZW的這種優(yōu)越性能為非侵入性跟蹤體內(nèi)細胞命運奠定了基礎(chǔ)。

在細胞中使用FE-4ZW孵育12小時后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有未內(nèi)化FE-4ZW的細胞培養(yǎng)基。將標記的細胞順序培養(yǎng)長達 7 天，每天收集上清液并通過 NIR-II 檢測器成像。所有收集的上清液均未觀察到可檢測到的 NIR-II 信號，而細胞本身表現(xiàn)出明亮的 NIR-II 熒光信號，這表明標記細胞中細胞內(nèi) FE-4ZW 染料的穩(wěn)定內(nèi)化（圖 2E、F）。另一個補充需求是體內(nèi)細胞追蹤，即使在主要標記信號顯示細胞增殖過程中耗盡后，也能充分檢測增殖的細胞。即使細胞計數(shù)呈指數(shù)增長（經(jīng)CCK8測定證實），穩(wěn)定的NIR-II熒光信號仍可檢測到長達6天（圖2G-I）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)E-4ZW在細胞中的標記和/或內(nèi)化可以維持很長時間，從而為利用高對比度NIR-II熒光生物成像在細胞水平上監(jiān)測復(fù)雜的生理過程提供了機會。

圖3. 通過使用 FE-4ZW 進行第二次近紅外 （NIR-II） 熒光成像來跟蹤移植神經(jīng)干細胞 （NSC） 的位置

 

通過用 FE-4ZW 預(yù)培養(yǎng) NSC 來證明活體 NSC 跟蹤，然后靜脈注射標記的 NSC。根據(jù)既定方案，通過離心仔細收集FE-4ZW標記的發(fā)光NSC，隨后靜脈內(nèi)移植到Balb / C小鼠模型的血液循環(huán)系統(tǒng)中（圖3A）。NIR-II熒光信號在立即觀察時提供了清晰的肺部輪廓，從而揭示了標記的NSC首先在肺部積聚。這一結(jié)果與之前關(guān)于間充質(zhì)干細胞監(jiān)測的報道一致。肺內(nèi)FE-4ZW標記的NSC的NIR-II熒光信號隨著時間的推移逐漸減少，并在72小時時間點后幾乎消失。在整個實驗過程中，肝臟中的NIR-II熒光信號逐漸增加。這些結(jié)果證實，靜脈注射后移植的NSC在肺部初始積累后逐漸轉(zhuǎn)運到肝臟（圖3B-E）。通過跟蹤NSCs進行縱向無創(chuàng)實時體內(nèi)成像，可為臨床NSC治療的生理機制和障礙的檢測提供便捷的細胞跟蹤技術(shù)。

監(jiān)測腫瘤細胞在體內(nèi)的命運對于研究潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但目前的非侵入性策略未能實現(xiàn)這一目標。皮內(nèi)注射FE-4ZW標記的4T1腫瘤細胞，并觀察到腫瘤細胞（或細胞聚集簇）隨著時間的推移沿著淋巴管遷移（圖3F），從而最終接種在相鄰的淋巴結(jié)中（圖3G，H）。通過體外泄漏實驗和細胞增殖實驗來測試FE-4ZW的細胞內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在細胞內(nèi)化后，F(xiàn)E-4ZW可以穩(wěn)定地存在于細胞區(qū)室中（圖2D-I）。此外，體內(nèi)NSC細胞追蹤結(jié)果顯示，F(xiàn)E-4ZW標記的NSCs在肺內(nèi)停留了很長時間，并逐漸循環(huán)到肝臟。這表明內(nèi)部化的FE-4ZW沒有與NSC分離。如果FE-4ZW從細胞中分離出來，肺的輪廓將迅速消失（圖3B，D）。圖3F中沿淋巴管自由移動的熒光點的存在表明細胞聚集簇沿著淋巴管運輸，而不是FE-4ZW染料自由移動。本文報道的方法可能適用于監(jiān)測腫瘤細胞的命運和遷移途徑，從而可以識別腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵參數(shù)。

圖4. FE-4ZW可用于淋巴通路的體內(nèi)成像和跟蹤腦腫瘤細胞循環(huán)

 

為證明 FE-4ZW 作為造影劑在體內(nèi)跟蹤 CSF 循環(huán)和跟蹤 MLV 和頸部淋巴結(jié)中細胞遷移的潛力。圖4A說明了證明FE-4ZW作為腦脊液追蹤器潛力的實驗過程。Cisterna Magna （CM） 的曝光過程、FE-4ZW 的CM 注射和獲取 NIR-II 圖像的過程均在 ISO 麻醉下進行。圖4B顯示了FE-4ZW在腦背側(cè)分布的代表性時程圖像，表明FE-4ZW可以通過完整的頭皮進行CM輸送來對腦脊液循環(huán)通路進行成像。之后，我們收集了腦組織，并對FE-4ZW在腦組織表面以不同姿勢的分布進行了成像。圖4C顯示CM注射的FE-4ZW沿PVS分布和大腦中動脈周圍的PVS輪廓被清晰地照亮（圖4D）。在證明FE-4ZW 作為所需的 CSF 示蹤劑后，我們通過 CM 注射 FE-4ZW 標記的 GL261 細胞對腦腫瘤細胞遷移進行了體內(nèi)監(jiān)測（圖 5E）。注射FE-4ZW標記的GL261細胞后，我們監(jiān)測了GL261腦腫瘤細胞的行進途徑。對明確的MLV結(jié)構(gòu)進行成像，表明CM注射的細胞沿著MLV隨腦脊液循環(huán)而行進（圖4F）。消失的MLV結(jié)構(gòu)意味著注射的細胞具有時間依賴性遷移過程（圖4F，G）。在細胞循環(huán) 2 小時后收集 MLV，并通過內(nèi)部 NIR-II 熒光顯微鏡對 MLV 內(nèi)細胞的分布進行成像。代表性圖像顯示，注射的細胞主要分布在覆蓋橫竇和嗅球的MLV內(nèi)（圖4H，I）。然后，我們?nèi)コ龑m頸皮膚，并在成像裝置下暴露CLNs，在允許細胞循環(huán)2小時后，周圍的熒光信號表明CLN（sCLNs和dCLNs）可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾�。ㄈ缒X腫瘤）具有重要功能（圖4J）。使用NIR-II熒光顯微鏡來觀察注射細胞在sCLNs和dCLNs中的詳細分布。被明亮熒光點覆蓋的 sCLN 和 dCLN 意味著GL261 細胞簇已遷移到 sCLN 和 dCLN 中（圖4K）。FE-4ZW標記組的熒光面積大于PBS組，進一步證實了sCLNs和dCLNs充滿了標記的GL261細胞（圖4L）。體外細胞成像和體內(nèi)細胞跟蹤研究的結(jié)果證實，F(xiàn)E-4ZW可以作為細胞造影劑。FE-4ZW的優(yōu)點包括：（1）充分保持光穩(wěn)定性，能夠滿足重復(fù)的成像要求;（2）高效的細胞標記能力，無需使用CPP，如TAT，CPP的一種。

具有拴系兩性離子泡沫銨末端基團的 NIR-II 熒光發(fā)射 S-D-A-D-S 熒光團提供了一種無需 CPP 即可高效標記活細胞的方法。引入的四性離子磺化銨末端基團不僅賦予FE-4ZW優(yōu)異的水溶性，而且提高了與各類細胞共孵育時與細胞膜的親和力。FE-4ZW用于體內(nèi)監(jiān)測移植細胞的命運和腦腫瘤細胞遷移到頸部淋巴結(jié)的命運。FE-4ZW染料在細胞中內(nèi)化并保留在細胞中，基于形態(tài)學(xué)沒有明顯的細胞毒性。此外，NIR-II熒光染料FE-4ZW可對標記細胞進行長期監(jiān)測和可視化。此外，盡管NIR-II熒光信號強度隨著原代FE-4ZW標記細胞的增殖而降低，但增殖6 d后的NIR-II熒光信號強度仍可檢測到。

干細胞療法可以通過減少炎癥和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來修復(fù)目標位置的受損細胞，因此評估施用的NSC的積累效率至關(guān)重要。得益于高NIR-II熒光信號強度和優(yōu)異的細胞內(nèi)化學(xué)/光穩(wěn)定性，使用FE-4ZW對NSCs的轉(zhuǎn)移和生物分布進行了非侵入性追蹤。這是首次利用不含CPP的有機小分子NIR-II熒光發(fā)射熒光團，以監(jiān)測小動物模型中靜脈注射后干細胞的遷移過程。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，癌細胞可以從原發(fā)腫瘤中逃逸，與血液和/或淋巴管一起遷移，并在遠處器官/組織中播種新的腫瘤。本文量身定制的熒光團還提供了一種潛在的方法，可以使用非侵入性途徑在體內(nèi)可視化此類轉(zhuǎn)移過程的特定方面。

先前的報道表明，在花青NIR-I熒光發(fā)射熒光團上修飾兩性離子基團可以降低熒光團與蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而賦予花青染料更快的腎臟排泄速度。NIR-II 發(fā)射熒光團 （FE-4ZW） 的兩性離子 S-D-A-D-S 結(jié)構(gòu)促進了對細胞膜的高親和力和相互作用。所設(shè)計的兩性離子泡沫銨基團是FE-4ZW高內(nèi)化能力的確定因素。FE-4ZW的標記效率高于其他FE染料（FE-2PEG、FE-2PEG2ZW和FE-4SO3Na）。FE-4ZW的細胞攝取機制包括能量依賴性內(nèi)吞作用和能量依賴性被動轉(zhuǎn)運。通過培養(yǎng)溫度的降低和額外的內(nèi)吞抑制劑觀察到的明顯的熒光信號強度消耗表明，內(nèi)吞作用是FE-4ZW的少數(shù)潛在攝取途徑之一。另一種攝取機制可以用以下幾點來解釋：（1）FE-2PEG未能內(nèi)化為固定細胞，甚至無法將工作濃度提高到50μM;（2）在低溫條件下或在抑制劑存在下進行細胞攝取不能分別完全抑制FE-4ZW的攝取。此外，使用TPGS/FE-4ZW混合物后，F(xiàn)E-4ZW的肝臟和脾臟積累減少。FE-4ZW為提高體內(nèi)細胞追蹤的成像質(zhì)量提供了令人興奮的可能性。為了解決一些未滿足的實際需求，可以考慮以下改進：（1）由于與波長相關(guān)的穿透深度，將FE-4ZW的發(fā)射波長擴展到NIR-IIb可以進一步提高成像質(zhì)量;（2）簡化FE-4ZW的合成工藝，使其更適合臨床應(yīng)用�？傮w而言，NIR-II 熒光發(fā)射熒光團 FE-4ZW 為高分辨率非侵入性跟蹤移植細胞提供了一種便捷的策略，并為在 NIR-II窗口中生產(chǎn)發(fā)射熒光信號的高性能細胞成像劑提供了合理的設(shè)計策略。

 

參考文獻

Sun B, Ma R, Wang X, et al. A high‐performance cell‐labeling NIR‐II dye for in vivo cell tracking[J]. View, 2024, 5(2): 20230097.

 

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