7月11日，賽業(yè)生物細(xì)胞治療部體外藥效項(xiàng)目管理宋子曦主講「CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)策略及體外抗腫瘤活性評估介紹」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:
1.靶分子在T細(xì)胞表面高表達(dá)的情況下開發(fā)CAR-T的風(fēng)險(xiǎn)和對應(yīng)策略？
2.裸鼠可以用于荷瘤并進(jìn)行CAR-T治療研究嗎？
3.靶向小鼠和人的CAR-T設(shè)計(jì)區(qū)別是？
4.CAR分子設(shè)計(jì)應(yīng)該給氨基酸還是核苷酸序列，如何優(yōu)化？
5.轉(zhuǎn)染NK的慢病毒滴度要求達(dá)到多高？
6.CAR分子載體的長度是多少？
 

Q：靶分子在T細(xì)胞表面高表達(dá)的情況下開發(fā)CAR-T的風(fēng)險(xiǎn)和對應(yīng)策略？
A：如果靶分子在T細(xì)胞表面也高表達(dá)，開發(fā)針對該靶分子的CAR-T細(xì)胞可能會導(dǎo)致自殺效應(yīng)或自我損傷。因此，以下策略可以考慮：
a.選擇不同的靶分子：選擇腫瘤特異性表達(dá)的分子作為靶點(diǎn)。
b.優(yōu)化CAR設(shè)計(jì)：使用更精確的抗原識別結(jié)構(gòu)域，減少對正常T細(xì)胞的識別。
c.使用雙特異性CAR：設(shè)計(jì)能識別兩個(gè)不同靶點(diǎn)的CAR，提高特異性，減少對正常細(xì)胞的毒性。
d.基因編輯：敲除或調(diào)控T細(xì)胞表面高表達(dá)的靶分子，以避免自殺效應(yīng)。

Q：裸鼠可以用于荷瘤并進(jìn)行CAR-T治療研究嗎？
A：可以。不過裸鼠（Nude mice）缺乏胸腺，導(dǎo)致T細(xì)胞缺陷，但是仍保留部分免疫功能，如B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），這可能影響研究結(jié)果。如果條件允許的情況下更推薦使用賽業(yè)生物NKG小鼠，NKG小鼠缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，是目前最免疫缺陷的小鼠模型之一，能夠更好地接受人類細(xì)胞移植。

Q：靶向小鼠和人的CAR-T設(shè)計(jì)區(qū)別是？
A：簡單來說，靶向小鼠和人的CAR-T設(shè)計(jì)的區(qū)別主要在于以下幾個(gè)方面：
a.抗原特異性：由于小鼠和人的基因不同，它們表達(dá)的腫瘤抗原也不同。因此，CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)時(shí)，針對小鼠的會使用識別小鼠抗原的特異性抗體片段，而針對人的則會使用識別人類抗原的特異性抗體片段。
b.設(shè)計(jì)和生產(chǎn)細(xì)節(jié)：雖然CAR-T設(shè)計(jì)的基本原理相同，但在具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，如啟動子選擇、信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化等方面，可能需要根據(jù)目標(biāo)物種的特性進(jìn)行調(diào)整。

Q：CAR分子設(shè)計(jì)應(yīng)該給氨基酸還是核苷酸序列，如何優(yōu)化？
A ：CAR分子設(shè)計(jì)提供氨基酸序列或核苷酸序列都可以，我們得到序列后會進(jìn)行對應(yīng)物種的密碼子優(yōu)化。
關(guān)于CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上的優(yōu)化包括增加細(xì)胞內(nèi)信號序列、調(diào)整跨膜區(qū)域、選擇合適的共刺激因子等等。

Q：轉(zhuǎn)染NK的慢病毒滴度要求達(dá)到多高？
A：轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞的慢病毒滴度要求可以因?qū)嶒?yàn)條件和目的而異。一般來說，需要足夠高的滴度確保高效率的轉(zhuǎn)染。常見的要求一般在10^8 TU/ml以上。如果提供病毒滴度或MOI仍然得不到較高的準(zhǔn)染效率，可以考慮通過轉(zhuǎn)座子載體電轉(zhuǎn)NK進(jìn)行CAR-NK的制備。

Q：CAR分子載體的長度是多少？
A: CAR分子載體的長度取決于其組成部分。一個(gè)典型的CAR分子載體包含以下主要部分：
a.單鏈抗體片段（scFv）：大約750-800個(gè)堿基。
b.鉸鏈區(qū)（Hinge region）：大約150-300個(gè)堿基。
c.跨膜區(qū)（Transmembrane domain）：大約150-300個(gè)堿基。
d.共刺激信號域（Co-stimulatory domain）：如CD28或4-1BB，大約200-300個(gè)堿基。
e.激活信號域（Signaling domain）：如CD3ζ鏈，大約150-300個(gè)堿基。

總的來說，整個(gè)CAR分子的核苷酸序列長度大約在1500-2000個(gè)堿基對之間。這是一個(gè)概略的估計(jì)，具體長度可能會根據(jù)不同的設(shè)計(jì)和優(yōu)化有所變化。