熒光檢測是工具鼠研究中的重要手段，不僅能評估重組效率還能進行基因表達譜可視化分析和遺傳譜系示蹤。然而，有時會遇到熒光信號無法被檢測的困擾，應該怎么辦呢？

在飲食、生活方式等因素的多重作用下，“減肥”和“降脂”話題的熱度不斷攀升。研究脂肪不僅是關乎體態(tài)，而且還與代謝類疾病等健康問題密切相關。今天，小賽要為大家介紹的是一款特異性靶向脂肪細胞的“定位系統(tǒng)”——Adipoq-iCre小鼠（產品編號：C001529）。

Adipoq-iCre小鼠
ADIPOQ基因編碼的脂聯素是一種蛋白質激素，僅由脂肪細胞產生，并通過血液傳輸到肌肉和肝細胞。脂聯素調節(jié)與脂肪儲存和代謝相關的多種途徑，包括調節(jié)血糖水平、脂肪酸分解、棕色脂肪細胞分化和糖異生的負調控等。

賽業(yè)生物利用基因編輯技術自主研發(fā)構建了Adipoq-iCre小鼠（產品編號：C001529），該模型在小鼠Adipoq基因調控元件的驅動下表達密碼子優(yōu)化后的Cre重組酶（iCre）。iCre重組酶的表達模式與內源基因相似，且內源性Adipoq基因表達不受影響。當Adipoq-iCre小鼠與含有l(wèi)oxP位點的小鼠進行雜交時，其子代小鼠的白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中可以發(fā)生由Cre重組酶介導的loxP位點間的序列重組。

白色脂肪和棕色脂肪中的Cre重組活性

圖1 白色脂肪和棕色脂肪中tdTomato蛋白表達的免疫熒光（IF）檢測

將Adipoq-iCre小鼠與條件性表達tdTomato熒光蛋白的Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配，取子代的白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）進行免疫熒光（IF）檢測。檢測結果顯示在Cre+小鼠的脂肪組織中存在大量的tdTomato紅色熒光信號。

其他組織中的Cre表達情況

圖2 骨骼肌、皮膚、肺部、心臟、睪丸和卵巢中tdTomato蛋白表達的免疫熒光（IF）檢測

結果顯示，在Cre+小鼠的骨骼肌、皮膚、肺、支氣管中檢測到部分紅色熒光，同時在小鼠的心臟、卵巢周圍脂肪、卵巢間質和黃體中存在極少量的熒光信號，而在睪丸中未觀察到熒光信號。

總  結
在Adipoq-iCre小鼠（產品編號：C001529）中，Cre重組酶的表達主要集中于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中，組織表達特異性良好。此外，在小鼠骨骼肌、皮膚、肺部和心臟中存在部分重組信號，根據組織學形態(tài)結構分析推測該類細胞可能是脂肪細胞。因此，該模型可用于靶向脂肪的組織特異性研究。

問：熒光檢測是工具鼠研究中的重要手段，不僅能評估重組效率還能進行基因表達譜可視化分析和遺傳譜系示蹤。然而，有時會遇到熒光信號無法被檢測的困擾，應該怎么辦呢？

答：我們有時會遇到熒光信號無法被檢測的困擾，以下提供一些原因分析及解決方案：
1. 熒光信號直接被破壞
(1) 熒光淬滅
在冰凍切片過程中，熒光信號容易被淬滅。直接使用熒光顯微鏡觀察時，務必避光操作，或改用免疫熒光或免疫組化。此外，還可以與其他熒光報告鼠配繁來放大熒光信號以便觀察。

(2) 樣品處理不當
樣品固定、封閉或染色步驟處理不當可能導致熒光信號減弱甚至丟失。

2. 基因表達的連鎖影響
(1) 重組酶表達水平低
Cre重組酶表達水平低或活性不足會導致目標基因flox位點重組效率低，進而無法檢測到熒光信號。例如，CMV-Cre小鼠的Cre基因打靶在X染色體上，X染色體的隨機失活可能導致基因組鑒定為Cre陽性，但Cre蛋白卻未表達。此外，CMV啟動子還易受表觀遺傳修飾沉默，也會導致重組現象不發(fā)生。

(2) 誘導條件不充分
例如他莫昔芬誘導Cre入核表達時，使用了不正確的誘導劑量及周期會影響Cre表達，進而影響報告鼠Rosa26-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato的熒光表達。因此，在正式實驗前建議進行預實驗摸索最佳誘導條件，或嘗試更高效的Cre表達系統(tǒng)。

(3) 模型設計的影響
例如在構建熒光工具鼠時，熒光是通過IRES元件連接在下游位置。由于IRES元件本身的特點，連接前后的基因雖然是共表達，但是位于IRES元件后的表達量是較低的，因此熒光強度受到影響。如果再加上使用的是弱啟動子驅動表達，那熒光檢測將更加困難。

3. 實驗操作中被忽視的細節(jié)
(1) 減少背景熒光干擾
由于觀測位置和深度不同，激發(fā)光和發(fā)射光容易被組織吸收，導致高背景和低信噪比，檢測靈敏度受限。需要對檢測組織進行除毛處理，或使用自發(fā)熒光淬滅劑處理樣品，選擇避開自發(fā)熒光峰值波長的熒光蛋白或染料。同時設立對照組，以便快速排除失敗原因。

(2) 確認實驗材料
檢查并確認熒光抗體、熒光染料等的質量和適用性。

(3) 確認實驗參數
選擇合適的波長，例如tdTomato的激發(fā)波長為554nm，發(fā)射波長為581nm。

(4) 確認基因型
在實驗前使用PCR檢測樣本的基因型是非常必要的，再使用qPCR或WB等(因樣本而異）檢測特異性組織的表達情況。