RAD-Seq（Restriction-site Associated DNA Sequence），對全基因組中處于限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)附近的片段進(jìn)行測序。RAD-Seq是開發(fā)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的高效方法，可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、QTL定位、群體遺傳分析等。

 

相比全基因組測序，RAD-Seq具有如下優(yōu)勢：
（1）大幅降低基因組復(fù)雜度；
（2）降低建庫和測序成本；
（3）不受參考基因組的限制，研究物種范圍更廣泛；
（4）相同通量情況下，一次測序可檢測更多樣本，尤其適合群體遺傳研究。

ddRAD-Seq是在傳統(tǒng)RAD-Seq基礎(chǔ)上發(fā)展而來的雙酶切簡化基因組測序技術(shù)，與RAD-Seq的主要區(qū)別在于，基因組DNA通過一個稀有限制性內(nèi)切酶與一個常見限制性內(nèi)切酶相結(jié)合進(jìn)行雙酶切，免去打斷的步驟直接進(jìn)行片段篩選后測序。

 

如圖所示，對基因組進(jìn)行雙酶切并輔以酶切產(chǎn)物的片段大小篩選，得到的序列就是兩端為不同酶切位點(diǎn)且長度接近的片段，如圖中藍(lán)色區(qū)域。a、b兩處雖然也在不同的酶切位點(diǎn)之間，但因大小不符而被篩除。因此，ddRAD-Seq對DNA文庫的篩選更為嚴(yán)格，在通量相同的情況下比單酶切法的測序深度更深，準(zhǔn)確度更高，也能檢測更多的樣本，提高數(shù)據(jù)的利用率。

因此，構(gòu)建ddRAD-Seq文庫需要對酶切后的基因組DNA進(jìn)行高精確度的片段篩選，傳統(tǒng)的手工切膠難以達(dá)到準(zhǔn)確度的要求，Sage Science公司的Pippin系統(tǒng)在此方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢。

 

2023年美國密西西比州立大學(xué)基因組學(xué)和生物技術(shù)研究所的科學(xué)家發(fā)表了一篇“應(yīng)用新方法的雙酶切限制性位點(diǎn)DNA測序(ddRAD-Seq)進(jìn)行更高效的SNP鑒定”的方法學(xué)文章。新的方案提高了實(shí)驗(yàn)效率并減少了ddRAD-Seq的時長，為了證明其實(shí)用性，作者比較了新方案的SNP與來自全基因組重測序數(shù)據(jù)的SNP。結(jié)果表明，相比現(xiàn)有方法，改進(jìn)的ddRAD-Seq方法在識別系統(tǒng)發(fā)育和關(guān)聯(lián)遺傳研究的單核苷酸多態(tài)性分析方面是可靠的，同時降低了成本和時間。

 

Fig 1. 改進(jìn)的ddRAD-Seq實(shí)驗(yàn)方法流程圖。(A)從基因組DNA提取到測序文庫構(gòu)建的過程。(B)構(gòu)建的文庫，經(jīng)過Sage ELF片段篩選儀進(jìn)行295—614 bp片段篩選，最后經(jīng)Illumina Hiseq X Ten測序

在ddRAD-Seq測序文庫制備過程中，使用Sage Science公司的Sage ELF高精度DNA片段分選回收儀對295-614bp的DNA片段，進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地回收，確保Illumina測序在最佳片段范圍內(nèi)。

同時作者也提出嵌合體的存在會造成序列讀取不匹配，為了盡可能減少嵌合體的存在，需要將文庫大小控制在364-444 bp之間，推薦使用Sage Science公司的系列片段回收儀Sage ELF 或 Blue Pippin 作為DNA片段精準(zhǔn)篩選回收方法。

 

 

文章是來自復(fù)旦大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)關(guān)于應(yīng)用ddRAD-seq技術(shù)，用于大規(guī)模植物種群遺傳多樣性分析。作者開發(fā)了一個通用的計(jì)算工具，優(yōu)化植物RAD-seq設(shè)計(jì)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性。優(yōu)化的RAD-seq方法能夠在文庫構(gòu)建過程中去除葉綠體DNA和rRNA基因，同時保持所需的覆蓋均勻性和密度。

 
 

通過優(yōu)化選擇限制性酶切位點(diǎn)（REs），同時引入精確的DNA片段大小篩選回收技術(shù)，顯著提高了RAD-seq的效率和準(zhǔn)確性。整個建庫過程中，在兩個步驟上均使用Pippin Prep作為DNA片段大小篩選回收工具（上圖左）。經(jīng)過DNA片段篩選后，每一個測序文庫超過90%的被測序片段都落在目標(biāo)大小范圍內(nèi)（220—420 bp）（上圖右）。

 

期刊：Molecular Ecology（IF5.2）
發(fā)表年份：2023年6月7號
物種：龜科——哥倫比亞紅足龜
文庫類型：基于3種限制性內(nèi)切酶的簡化基因組測序文庫即3RAD-Seq文庫
文庫富集和精準(zhǔn)回收：使用 Sage Science公司的Pippin Prep全自動DNA片段分選回收儀對350至450 bp之間的片段大小進(jìn)行選擇，在Illumina NovaSeq SP平臺進(jìn)行了文庫測序。

 

期刊：Molecular Ecology（IF 5.2 ）
發(fā)表年份：2023年
物種：歐洲熊峰bumblebee specimens (Bombus terrestris)
文庫類型：ddRAD 文庫，A single quaddRAD library
文庫富集和精準(zhǔn)回收：利用Sage Science公司的Pippin Prep全自動DNA片段分選回收儀制備quaddRAD文庫，片段大小從450-550 bp精確回收，然后使用Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行測序。

Sage Science公司的Pippin系列全自動DNA片段回收系統(tǒng)對于RAD-seq及ddRAD-seq方法在精確回收目標(biāo)片段，提高測序效率、減少非目標(biāo)序列的干擾上有重要幫助，是大規(guī)模種群遺傳多樣性分析、遺傳連鎖分析、關(guān)聯(lián)映射、生態(tài)和進(jìn)化研究領(lǐng)域的重要工具�？蓮V泛用于生命科學(xué)、農(nóng)、林、牧、漁等多方面研究。

文獻(xiàn)：
1、Zenaida V. M et al. “Innovations in double digest restriction-site associated DNA sequencing (ddRAD-Seq) method for more efficient SNP identification” Analytical Biochemistry 662 (2023) 115001
2、Ning Jiang et al. “A highly robust and optimized sequence based approach for genetic polymorphism discovery and genotyping in large plant populations” Theor Appl Genet (2016) 129:1739–1757
3、Natalia GG, Mario VR, H. Bradley Shaffer,et al. "The importance of cryptic diversity in the conservation of wide-ranging species: The red-footed tortoise Chelonoidis carbonarius in Colombia" Molecular Ecology, 2023;32:4531–4545.
4、Paolo F, Carmelo F, Thomas J., et al. "Limited introgression from non-native commercial strains and signatures of adaptation in the key pollinator Bombus terrestris." Molecular Ecology, Volume32, Issue21 November 2023 Pages 5709-5723

 

美國Sage Science是全球領(lǐng)先的全自動DNA脈沖場電泳回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國技術(shù)專利，各個型號產(chǎn)品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準(zhǔn)回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。

環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區(qū)的獨(dú)家代理商，自2011年以來將Sage Science的產(chǎn)品線引入國內(nèi)，一直為國內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收儀的安裝測試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護(hù)工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。


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