最近很火的MBTI測試不知道大家都測試過了嗎？那么你是開朗外向的“E人”呢，還是善于觀察思考內(nèi)向的“I人”呢？

MBTI測試將人的性格分為了16型，主要包括四大類：分析型、穩(wěn)健型、和諧型、自由型，有的人可能適合投身科研領(lǐng)域成為偉大的科學(xué)家，而有的人可能邏輯性強，責(zé)任心重具備成為leader的潛質(zhì)，再有的人可能感情細(xì)膩，富有同情心投身醫(yī)療、教育事業(yè)……無論你是哪種人，看完今天的知識點，保證你會是一名合格的“P人”。

看到這里的小伙伴都會有疑問了

什么是“P人呢”？

P就是在我們?nèi)粘�實驗，尤其是小鼠實驗中的各種PCR包括：PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR等。下面我就一一為大家講解。
 
PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1976年，中國科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。主要反應(yīng)步驟可以總結(jié)為：高溫變性，低溫退火，中溫延伸。

① 高溫變性：通過高溫（約95℃）加熱一定時間，將模板DNA解離成單鏈的形式，以便與引物結(jié)合；② 低溫退火（復(fù)性）：降溫至約55℃時，引物與模板DNA單鏈按照堿基互補配對原則結(jié)合；③ 中溫延伸：再將溫度調(diào)至約72℃（適合DNA聚合酶反應(yīng)的溫度），在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板和引物結(jié)合物沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向，按照堿基配對和半保留復(fù)制原則合成一條新的、與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。通過經(jīng)歷變性、退火和延伸幾個循環(huán)后，待擴增的基因可以被擴增放大幾百萬倍^（1）。
 
這類PCR在小鼠中主要用于基因敲除和敲入小鼠等轉(zhuǎn)基因生物的基因型鑒定^（2）。

當(dāng)然在開始PCR前DNA的抽提將決定整個實驗的成敗，DNA的抽提方法及后續(xù)建議使用濃度可以參考我們之前的推文：

https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2382/post_type/1.html

在反應(yīng)過程中有的時候會發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了非預(yù)期條帶，那么可能是您的反應(yīng)體系存在污染，這部分內(nèi)容之前我們也有詳細(xì)的介紹如何避免污染哦：https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2384/post_type/1.html

qPCR
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。

1 TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
 

2 SYBRGreenⅠ熒光染料法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性）

數(shù)據(jù)分析
通過實時熒光收集到的信號，儀器會自動繪制熒光曲線，通常5-15個循環(huán)的熒光信號都屬于背景信號，然后將其設(shè)置為擴增曲線的背景或基線。在理想條件下，PCR產(chǎn)物量呈指數(shù)倍增長Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循環(huán)次數(shù)，Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量）。但實際上可能引物模板引物消耗完，DNA聚合酶逐漸失活等原因，產(chǎn)物量就恒定。熒光強度就呈“S型”曲線即“擴增曲線（Amplication plot）”，分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。再根據(jù)待測樣品的Ct，可計算樣品拷貝數(shù)/濃度。通常模板每稀釋10倍，CT值增大3.33。如果研究基因表達(dá)量通過比較達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需的Ct值大小，可以比較出基因表達(dá)量的高低。
  1、普通基因表達(dá)水平的檢測：能夠快速準(zhǔn)確的定量出相關(guān)基因在不同組織或生命狀態(tài)下的相對表達(dá)水平，例如：CKO小鼠敲除效率的檢測。
2、基因拷貝數(shù)的檢測：能夠準(zhǔn)確的定量出相關(guān)基因在染色體中的拷貝數(shù)。
3、特殊RNA的轉(zhuǎn)錄水平檢測：根據(jù)特殊RNA的結(jié)構(gòu)，如microRNA、circRNA等，設(shè)計其特殊引物，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物、反向引物等，對這類RNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定性、定量分析。

RT—PCR
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。整個反應(yīng)過程分為兩步，第一步是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用，從RNA合成cDNA的過程；第二步是以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增目的片段的過程。

作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，3種都可^（3）。

RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進(jìn)行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，分成兩步進(jìn)行。
 

RT—PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

RT-qPCR
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實驗中的一種實驗方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程是在兩個管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計策略。
 

RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗證、微陣列驗證、病原體檢測、基因測試和疾病研究^（4）。

希望這篇“P文”能對您的實驗有一定幫助，讓您成為一個合格的“P人”。最后，大家如果不想在PCR鑒定上浪費時間，南模生物也可提供大小鼠基因型鑒定服務(wù)，更多詳情請聯(lián)系我們。

1.多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)研究和應(yīng)用．中國知網(wǎng)
2.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org
3.胡奇林，林鋒強，陳少鶯等.  應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測番鴨呼腸孤病毒．《中國獸醫(yī)學(xué)報》，2004
4.Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.

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