增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白EBFP、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP的介紹與應(yīng)用
自1962年GFP被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)熒光蛋白更深入的探索和應(yīng)用從未停止。通過(guò)一系列的探索，各種不同波長(zhǎng)的突變體熒光蛋白現(xiàn)世，大大擴(kuò)充了熒光蛋白的品類(lèi)，滿(mǎn)足了科學(xué)家們?cè)诓煌n題中的需求，并且在蛋白標(biāo)記、體內(nèi)示蹤等方面得到了廣泛應(yīng)用。
之前我們也介紹過(guò)GFP經(jīng)過(guò)改造后產(chǎn)生的不同顏色突變體，如黃色突變體（EYFP）、藍(lán)色突變體（EBFP）等。今天，小編就帶大家仔細(xì)了解一下這兩種突變體及其他熒光蛋白。
圖1 各色熒光蛋白生物成像圖
1 藍(lán)色熒光蛋白
增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（EBFP）有四個(gè)氨基酸突變，它的激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm。突變后的EBFP雖然在蛋白折疊及發(fā)色團(tuán)形成效率方面得到了改善，使其所發(fā)出的熒光亮度與BFP相比有所增強(qiáng)。但EBFP的熒光整體仍較弱，與野生型GFP熒光強(qiáng)度相近，成像時(shí)背景信號(hào)較高。
因此針對(duì)其研發(fā)出了3個(gè)更亮的熒光突變體：Azurite、EBFP2和mTagBFP，它們的亮度分別是EBFP的1.6倍、2倍和3.7倍。其中，mTagBFP是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來(lái)的。
圖2 成纖維細(xì)胞 （皮膚細(xì)胞）用熒光染料標(biāo)記（圖片來(lái)源于包圖網(wǎng)）
2 黃色熒光蛋白
增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）是最早的黃色熒光蛋白突變體，有四個(gè)氨基酸發(fā)生突變，使得EYFP的發(fā)射光變?yōu)辄S綠色，且熒光強(qiáng)度與EGFP熒光強(qiáng)度相似。不過(guò)EYFP雖已被廣泛應(yīng)用，但它本身存在一些缺陷導(dǎo)致其并非最理想的熒光蛋白。
目前，mCitrine和mVenus在EYFP基礎(chǔ)上改進(jìn)的黃色熒光變體應(yīng)用較為廣泛。另外，還有一種經(jīng)合成的DNA重排獲得的能量轉(zhuǎn)移黃色熒光蛋白YPet，亮度在黃色熒光蛋白中是最強(qiáng)的，且光穩(wěn)定性較強(qiáng)。同時(shí)，YPet比mVenus或者其他熒光蛋白對(duì)于酸性環(huán)境的耐受能力更強(qiáng)。
圖3 紡錘體中 YFP 表達(dá)的焦點(diǎn)成像（PLoS One. 2015;10(3):e0119538.）
對(duì)于細(xì)胞、組織來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)波長(zhǎng)光子的激發(fā)產(chǎn)生的光毒性更小，且動(dòng)物組織光吸收和自體熒光也更小。因此，紅色的熒光基團(tuán)因其較低的背景可以表現(xiàn)出更高的對(duì)比度，更適合于體內(nèi)成像。這使得熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。
3 紅色熒光蛋白
紅色熒光蛋白在1999年首次被報(bào)道，與綠色熒光蛋白GFP一樣，紅色熒光蛋白（DrFP583）也是從珊瑚蟲(chóng)中克隆的一種熒光蛋白，在紫外光激發(fā)下可發(fā)射紅色熒光。
紅色熒光蛋白的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)較GFP相比要更長(zhǎng)，成像時(shí)背景更低，且可與GFP共用，因此有較大應(yīng)用前景。但由于DrFP583易寡聚化、成熟緩慢等缺陷限制了它的應(yīng)用。因此通過(guò)對(duì)它進(jìn)行改造，得到了寡聚化程度更低、成熟速度更快的突變體DsRed。另外，還有紅色熒光突變體：mCherry、DsRed、tdTomato和mStrawberry等。
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mCherry具有優(yōu)異光穩(wěn)定性，是最通用紅色單體（但融合表達(dá)時(shí)有較弱的齊聚效應(yīng)）
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tdTomato具有mCherry相同的光穩(wěn)定性，亮度更強(qiáng)，是追蹤表達(dá)水平的理想選擇，但為串聯(lián)二聚體，可以在融合標(biāo)簽大小不干擾蛋白質(zhì)功能的情況下使用
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mStrawberry是最亮的紅色單體，但光穩(wěn)定性要弱于mCherry
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DsRed是細(xì)胞毒性最小的RFP
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mApple在蛋白的融合表達(dá)中是mCherry理想的替代物，但其光穩(wěn)定性要遠(yuǎn)弱于mCherry
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mKate2從參數(shù)方面考量是綜合亮度、光穩(wěn)定性和齊聚性的最佳RFP，但目前報(bào)道相對(duì)較少
圖4 基于雙同源重組系統(tǒng)的BASCs遺傳譜系示蹤（Nat Genet. 2019;51(4):728-738. ）
南模生物自主研發(fā)多種熒光蛋白工具鼠，即在目的基因的特定位置引入報(bào)告基因（包括熒光蛋白，如EGFP、mYFP等）或標(biāo)記基因的小鼠模型（部分小鼠模型見(jiàn)下表），與特定重組酶工具鼠雜交，可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞類(lèi)群標(biāo)記出所需熒光，幫助蛋白標(biāo)記、譜系示蹤等實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。如您有相關(guān)需求，歡迎撥打400-728-0660或者關(guān)注微信公眾號(hào)點(diǎn)擊在線(xiàn)咨詢(xún)，我們的專(zhuān)業(yè)團(tuán)隊(duì)將竭誠(chéng)為您服務(wù)！
表1：部分熒光蛋白工具鼠
[1] Kremers, G. J., Goedhart, J., van den Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C., & Gadella, T. W., Jr (2007). Improved green and blue fluorescent proteins for expression in bacteria and mammalian cells. Biochemistry, 46(12), 3775–3783. https://doi.org/10.1021/bi0622874
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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡(jiǎn)稱(chēng)"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專(zhuān)注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶(hù)提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。
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