期刊：Computers in Biology and Medicine
影響因子：6.929
伯豪服務(wù)產(chǎn)品：單細胞核測序、伯優(yōu)^®細胞核分離試劑盒

研究背景
肝囊腺瘤是一種罕見疾病，占所有囊性病變的約5%，具有較高的惡性轉(zhuǎn)化傾向。術(shù)前診斷囊腺瘤較為困難，一些囊腺瘤在初診時容易被誤認為肝囊腫。肝囊腫是一種相對常見的肝臟疾病，大多數(shù)為良性，但較大的肝囊腫可能導(dǎo)致膽管受壓，從而引起肝功能異常。近年來，對囊腺瘤和肝囊腫的研究越來越多，但大多仍停留在傳統(tǒng)的病例分析或臨床報告中，缺乏對囊腺瘤、肝囊腫的高通量研究。

研究目的
為了深入剖析囊腺瘤與肝囊腫的差異，本研究通過對囊腺瘤和肝臟囊腫樣本進行單核RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組測序，旨在揭露肝囊腫和囊腺瘤的微環(huán)境差異和分子特征，為囊腺瘤的診斷提供新的視角。

研究結(jié)果
1. 通過構(gòu)建囊腺瘤、肝囊腫的圖譜，揭示兩者在細胞組成上的差異
本研究通過單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序探索了肝囊腫和囊腺瘤的細胞組成差異，以此來分析兩者的腫瘤微環(huán)境�；�于tSNE (t-distributed stochastic neighbor embedding)分析的結(jié)果，通過降維聚類核已知的細胞標志物，研究從中發(fā)現(xiàn)了7類細胞。肝囊腫和囊腺瘤的樣本中均包含了這7類細胞。從數(shù)據(jù)中還可發(fā)現(xiàn)：（1）肝囊腫細胞中高表達PRKG1，LAMA2，CACNA1C（2）肝實質(zhì)細胞高表達CUX2，PCSK和FGL1（3）膽管上皮細胞高表達PKHD1，RALYL和DCDC2（4）內(nèi)皮細胞特異性表達ST6GALNAC3，F(xiàn)LT1和PTPRB（5）T細胞高表達SKAP1，PARP8和PTPRC（6）庫普弗細胞表達SLC1A3，TBXAS1和AOAH（7）祖細胞特異性表達NRXN1，XKR4和GRIK2。

雖然肝囊腫和囊腺瘤的樣本都有這7類細胞，但是細胞類型的占比上卻有顯著性差異。肝囊腫組織中有更多的膽管細胞和肝星狀細胞，囊腺瘤組織中則有更多內(nèi)皮細胞，肝實質(zhì)細胞，庫普弗細胞，T細胞和祖細胞。囊腺瘤中更多的T細胞說明了其相比肝囊腫，有著更強的免疫浸潤。為了驗證單細胞核測序的結(jié)果，研究還使用了空間轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)進行檢測，最后也得到了相似的結(jié)論。這說明了肝囊腫和囊腺瘤。
 

2. 囊腺瘤中的肝星狀細胞比肝囊腫中的更為惡性
肝星狀細胞（HSC）是纖維化的肝中的主要細胞類型。在肝臟受到損傷時，肝星狀細胞會進入激活狀態(tài)，進而成為生成肝損傷時細胞外基質(zhì)的主要來源。這也讓它成為肝病理學(xué)的的一個關(guān)鍵指標。研究發(fā)現(xiàn)，囊腺瘤和肝囊腫的組織中都有大量的肝星狀細胞。進一步對這些肝星狀細胞進行聚類分析，可以從中發(fā)現(xiàn)10個簇。而這10個簇在兩種病中的分布卻有明顯區(qū)別。在肝囊腫中，可以發(fā)現(xiàn)含PKHD1變異的簇，也有高表達PRG4和PDK4的簇。PKHD1變異已被確認會誘發(fā)嚴重多囊肝。PRG4則被發(fā)現(xiàn)和肝細胞癌患者預(yù)后有關(guān)，并會抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移。PDK4調(diào)節(jié)的糖酵解可以從鐵死亡中保護肝星狀細胞。在囊腺瘤中，F(xiàn)OSB顯著高表達。FOSB是肝細胞癌診斷和預(yù)后的重要標志物。
 

為了分析肝星狀細胞在兩種疾病中功能上的差異，他們又根據(jù)標志物分別對兩種疾病樣本中肝星狀細胞的基因進行了功能富集。結(jié)果顯示，在兩種疾病中，都富集到了和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生，復(fù)合結(jié)合相關(guān)基因。在肝囊腫組織中，還特異性地富集到了和細胞貼壁和抑制酶活相關(guān)的功能的基因。而細胞貼壁在癌癥進程中有著關(guān)鍵作用，它會促發(fā)包括免疫逃逸和轉(zhuǎn)移擴散的癌癥性狀。在囊腺瘤組織中，則富集到了蛋白結(jié)合和跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因�？缒まD(zhuǎn)運被認為在癌癥的發(fā)展和癌癥治療中的抗藥性中起到作用。
 

實驗還分析了兩種疾病中的肝星狀細胞的單細胞拷貝數(shù)變異（CNV）。由此發(fā)現(xiàn)兩種疾病組織中的肝星狀細胞在染色體2，3，4，10上存在顯著的拷貝數(shù)變異，而且囊腺瘤組織中的拷貝數(shù)變異要顯著高于肝囊腫組織中的。這說明囊腺瘤中的肝星狀細胞比肝囊腫中的更為惡性。
 

3. 細胞軌跡分析揭示了肝實質(zhì)細胞在囊腺瘤和肝囊腫中的動態(tài)變化
肝實質(zhì)細胞是肝組織中的占接近80%體積的實質(zhì)細胞亞簇。根據(jù)t-SNE算法，可以分出8類肝實質(zhì)細胞簇，而其中的簇3，4主要存在于肝囊腫組織中，簇1主要在囊腺瘤組織中。通過對基因表達模式的分析，可以發(fā)現(xiàn)簇3，4有著相似的表達模式。

另外，研究也通過Monocle2，對兩類疾病中的肝實質(zhì)細胞進行了細胞軌跡分析，進而發(fā)現(xiàn)了兩種疾病中肝實質(zhì)細胞分化模式上的區(qū)別。肝囊腫中的肝實質(zhì)細胞有7種狀態(tài)，包括了3種初始分支，和4種其它分支。其中，亞簇4，5主要在出現(xiàn)在分化的初期，而亞簇2，3則是在分化的末期。囊腺瘤種的肝實質(zhì)細胞則有5種狀態(tài)，包括了2種初始分支，和3種其它分支。其中，亞簇0主要在出現(xiàn)在分化的初期，而亞簇1，6，7則是在分化的末期。除此之外，研究者也對兩組數(shù)據(jù)進行了混合分析。由此可以得到5種狀態(tài)的肝實質(zhì)細胞，包括2個初始分支和3個其它分支。其中，來自肝囊腫的亞簇2，主要存在于分化的初期，而來自囊腺瘤的亞簇6，7則租戶要存在于分化末期。與此同時，在分化不同階段，表達量存在顯著差異的基因，隨著分化增多或是減少的基因也被一同分析得出。結(jié)合已有文章中對這些基因功能的研究，可以發(fā)現(xiàn)肝囊腫中的肝實質(zhì)細胞，存在向囊腺瘤中肝實質(zhì)細胞演化的趨勢。這些實驗結(jié)果表明了肝實質(zhì)細胞在這兩種疾病中的動態(tài)轉(zhuǎn)化過程。
 

4. T細胞的轉(zhuǎn)錄組分析揭示了囊腺瘤和肝囊腫中不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制
T細胞是腫瘤免疫治療中的重要元素，其在細胞組成上的高度異質(zhì)，表達模式和功能特征會顯著影響免疫治療的效果。在囊腺瘤和肝囊腫這兩類組織中，研究鑒定出了2047個T細胞。通過t-SNE，可以將這些T細胞分成5個簇。兩類疾病組織中，都可以發(fā)現(xiàn)這5類T細胞，但是比例卻明顯不同。例如0亞簇的T細胞在肝囊腫中的比例顯著高于囊腺瘤中的，1亞簇的情況則相反。通過差異表達分析可以發(fā)現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)不同簇中表達模式上的差異。功能富集的結(jié)果也表明不同簇存在高度的功能異質(zhì)性。亞簇0的T細胞主要和新陳代謝有關(guān)，細胞處于激增和激活的狀態(tài)。亞簇2主要和T細胞受體（TCR）信號通路有關(guān)。亞簇4則和FcγR調(diào)控的吞噬作用有關(guān)。這表明，囊腺瘤和肝囊腫中部分T細胞的免疫功能，可能通過FcγR調(diào)控的吞噬作用來實現(xiàn)。
 

另外，研究使用SCENIC分別鑒定了囊腺瘤和肝囊腫中每個T細胞簇的特異性調(diào)節(jié)因子。結(jié)果顯示，兩種疾病中T細胞簇特異性調(diào)節(jié)因子存在差異。因此，通過進一步構(gòu)建肝囊腫和囊腺瘤的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入探討了囊腺瘤和肝囊腫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊腺瘤和肝囊腫中不僅存在常見的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，而且存在兩種疾病的特異性轉(zhuǎn)錄因子和特異性靶基因。其中，調(diào)節(jié)靶基因數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子是FLI1，它廣泛調(diào)節(jié)囊腺瘤和肝囊腫中的多個靶基因。已有研究表明，F(xiàn)LI1可以通過調(diào)節(jié)趨化因子和細胞因子來影響免疫細胞的功能，也參與免疫細胞的發(fā)育、增殖、激活和遷移。此外，IKZF1僅在囊腺瘤中被發(fā)現(xiàn)，并且功能增強的IKZF1變體已被證明會導(dǎo)致與人類異常T細胞分化后期相關(guān)的免疫失調(diào)。在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的一組囊腺瘤患者（n=3）中，通過免疫組織化學(xué)（IHC）的方法，進一步證實了IKZF1蛋白在囊腺瘤組織中的表達，而肝囊腫中則沒有。此外，我們還鑒定了一些在囊腺瘤中特異性調(diào)控的靶基因，包括CHST11、ELMO1、DOCK8和LCP2等。IHC結(jié)果也顯示，這些基因在囊腺癌中有陽性信號，但在肝囊腫組織中沒有陽性信號。相反，RUNX1僅在囊腺瘤中發(fā)現(xiàn)。RUNX1可以直接或間接調(diào)節(jié)癌癥增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移，增加癌癥細胞干度和抗癌藥物耐藥性。同樣，IHC結(jié)果也證實了RUNX1在肝囊腫組織（n=3）中的特異性表達。上述結(jié)果表明，T細胞在囊腺瘤和肝囊腫中具有不同的調(diào)節(jié)機制，且囊腺瘤具有比肝囊腫更復(fù)雜的免疫微環(huán)境。
 

5. 囊腺瘤和肝囊腫中膽管細胞的差異性
膽管細胞是膽管的上皮細胞，呈柱狀，在肝門附近的大膽管和肝外膽管中分泌HCO3，通過運輸膽汁酸來促進肝細胞的存活。研究者借由t-SNE法鑒定了7個膽管細胞亞簇。囊腺瘤和肝囊腫均包含所有7個亞簇，但同樣的，不同亞簇的占比并不相同。同時，研究也分析了一系列的特征基因在每個膽管細胞簇中的表達情況。其中，亞簇1、2、5和6均高表達Adnexin A4（ANXA4）基因。研究表明，Anxa4在癌癥的診斷、預(yù)后和治療中起著重要作用。簇5特異性高表達TMC5，據(jù)報道，TMC5也是與肝細胞癌診斷和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。簇6高表達PSTPIP2。文獻證實，PSTPIP2的甲基化通過調(diào)節(jié)STAT1和NF-κB途徑增強酒精誘導(dǎo)的肝損傷中的炎癥。

隨后，研究又對肝囊腫和囊腺瘤中差異表達的膽管細胞標記基因進行了功能富集。膽管細胞的標志物在肝囊腫中特異性富集到了與ERK1和ERK2相關(guān)的功能的基因。ERK1和ERK2是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與Ras-Raf MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。該級聯(lián)參與調(diào)節(jié)多種過程，包括細胞粘附、細胞周期、遷移、存活、分化、代謝、增殖和轉(zhuǎn)錄。另外，在囊腺瘤中，則富集到了磷脂酰肌醇3−激酶的正調(diào)控相關(guān)基因。磷脂酰肌醇3-激酶是進化過程中生長因子信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素，也在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，包括胰島素信號傳導(dǎo)、細胞生長和免疫。有報道指出，肝囊腫中，存在膽管細胞起源的情況。這表明，膽管細胞可能通過ERK1和ERK2級聯(lián)反應(yīng)激活Ras-Raf MEK-ERK信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞粘附和細胞增殖等過程，導(dǎo)致肝囊腫的形成和發(fā)展。在囊腺瘤中，膽管細胞通過PI3K信號通路參與囊腺瘤的進展，PI3K可能是囊腺瘤的標志，PI3K信號通路的靶向治療可能抑制囊腺瘤的生長。
 

6. 囊腺瘤的內(nèi)皮細胞遷移能力高于肝囊腫的
內(nèi)皮細胞是人體內(nèi)的單層鱗狀上皮細胞，主要位于血管內(nèi)壁。研究通過t-SNE對內(nèi)皮細胞的進一步亞簇分析顯示，內(nèi)皮細胞被分為五個亞簇。同樣，肝囊腫和囊腺瘤都含有來自所有五個亞簇的細胞，但比例不同。同時，也對每個內(nèi)皮細胞亞群中特征基因的表達進行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，簇0特異性表達內(nèi)皮細胞的外排泵基因ABCB1。簇1特異性高表達可增加肝細胞癌的復(fù)發(fā)率的RELN。簇2高度表達與肝硬化高凝狀態(tài)相關(guān)的VWF基因。在差異表達內(nèi)皮細胞標志物的功能富集中，研究發(fā)現(xiàn)MAPK級聯(lián)相關(guān)功能基因在囊腺瘤中得到特異性富集。而MAPK級聯(lián)的異常調(diào)節(jié)可以影響在腫瘤發(fā)生中起重要作用的關(guān)鍵信號元件。同時，也特異性富集到與細胞粘附的正調(diào)控相關(guān)途徑的基因。細胞粘附介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的滲透屏障，將血流與下方器官和組織分離，并控制液體、溶質(zhì)和細胞沿血管壁的輸運。這表明囊腺瘤中的內(nèi)皮細胞比肝囊腫具有更高的遷移能力和更高的惡性風險。
 

本文的單細胞核測序分析展現(xiàn)了病變組織中囊腺瘤和肝囊腫細胞的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及其腫瘤微環(huán)境，闡明了囊腺瘤和肝臟囊腫微環(huán)境之間的差異。而在囊腺瘤和肝囊腫病變中，也鑒定出不同細胞類型的不同簇和亞簇，并確定了它們相應(yīng)的分子特征�？截悢�(shù)變異顯示囊腺瘤和肝囊腫中肝星狀細胞的惡性程度不同。囊腺瘤和肝囊腫的肝細胞分化模式也通過單細胞核測序數(shù)據(jù)分析得出。此外，T細胞的組成及其性質(zhì)表明，囊腺瘤具有更高的免疫浸潤性和更復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)機制。這項研究為囊腺瘤和肝囊腫提供了初步的細胞圖譜，并為后續(xù)分子水平研究奠定了基礎(chǔ)。

原文鏈接
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0010482524006255

關(guān)于本研究中使用的
snRNA-seq研究方法
單細胞核測序（Single-Nucleus RNA Sequencing, snRNA-seq）和單細胞測序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq）都是用于解析細胞異質(zhì)性的重要技術(shù)。而相比于常規(guī)的單細胞測序，單細胞核測序主要具有有以下特點和優(yōu)勢：
1. 樣本要求低：snRNA-seq可以從冷凍組織中提取核酸，而不需要新鮮樣本，這使得它在處理難以獲取的新鮮樣品或長期保存的組織樣品時具有顯著優(yōu)勢。
2. 減少技術(shù)誤差：單細胞核測序主要分析的是細胞核中的RNA，避免了細胞質(zhì)RNA提取過程中可能引入的技術(shù)誤差。
3. 處理復(fù)雜組織：snRNA-seq在處理復(fù)雜或堅韌的組織時，能夠更有效地分離細胞核，減少機械損傷和細胞死亡。
4. 捕獲特定細胞類型：對于一些難以分離的細胞類型或處于某些狀態(tài)的細胞，細胞核的分離和測序更為適用，避免了解離偏好性。
5. 避免細胞應(yīng)激反應(yīng)：在單細胞分離過程中，細胞質(zhì)RNA可能因解離細胞應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)生變化，而細胞核RNA相對穩(wěn)定，減少了應(yīng)激反應(yīng)的影響。

而通過本研究，也可以看到snRNA-seq在癌癥研究中的應(yīng)用前景：
1.腫瘤異質(zhì)性分析：snRNA-seq能夠深入解析腫瘤內(nèi)部的細胞異質(zhì)性，包括識別不同的癌細胞亞群和腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、基質(zhì)細胞等。
2. 腫瘤進化和耐藥性研究：通過分析癌癥組織中不同細胞核的基因表達譜，可以追蹤腫瘤進化過程，了解癌細胞如何發(fā)展耐藥性，為個性化治療提供依據(jù)。
3. 微環(huán)境研究：snRNA-seq可以分離并分析腫瘤微環(huán)境中的細胞核，揭示腫瘤與其微環(huán)境之間的相互作用，了解免疫逃逸機制。
4. 轉(zhuǎn)移研究：通過比較原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的細胞核RNA表達譜，研究腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點。

而該研究所使用的伯優(yōu)^®細胞核分離試劑盒是由伯豪生物獨立研究開發(fā)的產(chǎn)品。

產(chǎn)品優(yōu)勢：最大限度地維持細胞核膜的完整和染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得率高，雜質(zhì)少，不易成團。

產(chǎn)品應(yīng)用：表觀遺傳學(xué)研究（如scATAC- seq/bulk ATAC- seq，CUT&Tag）；核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq/bulk RNA-seq）等。

結(jié)果參考 

產(chǎn)品列表