基因編輯 (Gene Editing) 是指通過基因編輯技術(shù)對生物體基因組特定目標進行修飾的過程。

基因編輯技術(shù)自問世以來，已經(jīng)實現(xiàn)了從第一代鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFNs) 到第二代轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs) 的跨越，并最終發(fā)展至當前的第三代 CRISPR/Cas 系統(tǒng)。CRISPR/Cas 技術(shù)以其卓越的編輯效率、簡便的操作流程以及高度的精確度，成為基因編輯領(lǐng)域的主導(dǎo)技術(shù)，在基因篩選、模型構(gòu)建、機制研究中發(fā)揮了不可替代的作用[1][2]。

圖 1. CRISPR/Cas 相關(guān)的基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程^[3]。

 

在基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展中，Ⅱ 型 CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a (Cpf1) 以及 CRISPR/Cas13 系統(tǒng)因其卓越的性能和特異性而成為研究的熱點。這些系統(tǒng)不僅提高了基因編輯的效率和準確性，也為解決復(fù)雜的遺傳問題提供了新的工具。

同時，基于 CRISPR/Cas 平臺的單堿基編輯技術(shù) (Base Editing, BE) 和先導(dǎo)編輯技術(shù) (Prime Editing, PE)，以其無需雙鏈 DNA 斷裂即可實現(xiàn)精確的基因組編輯的能力，為基因治療和生物醫(yī)學(xué)研究帶來了革命性的變革[3]。

▐ CRISPR/Cas 基因編輯的工作原理：
(1) 原核生物獲得入侵病毒或質(zhì)粒的細胞記憶。感染后，入侵者的 DNA 序列以間隔陣列的形式整合到宿主 CRISPR 基因座中，間隔陣列兩側(cè)是重復(fù)序列，根據(jù)序列提供特定的噬菌體抗性。

(2) RNA 聚合酶從 CRISPR 位點的間隔區(qū)產(chǎn)生 RNA，稱為前 CRISPR RNA (前 crRNA)。前 crRNA 轉(zhuǎn)錄同時，來自 CRISPR 基因座上游的反式激活 crRNA  (tracrRNA) 被轉(zhuǎn)錄以實現(xiàn)兩個基本功能：誘導(dǎo) RNase III 酶的前 crRNA 成熟，以及激活 crRNA 引導(dǎo)的 DNA 裂解。

(3) tracrRNA&crRNA 復(fù)合物加載到 CRISPR 相關(guān)核酸酶 9 (Cas9) 上，形成活性核糖核蛋白 (RNP) 復(fù)合物。雙鏈 RNA結(jié)構(gòu)指示 Cas9 在與 crRNA 間隔序列互補的位點處引入 DNA 雙鏈斷裂 (DSB)。CRISPR 和 Cas9 共同在細菌抵抗噬菌體感染和質(zhì)粒結(jié)合方面發(fā)揮協(xié)同作用(具體過程如圖 2 所示)[4]。

圖 2.  Ⅱ 型 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的工作原理^[4]。

a. 在獲取階段，被噬菌體感染后，來自入侵者的 DNA 序列以間隔序列的形式整合到宿主 CRIPSPR 位點中，并以重復(fù)序列為間隔。b. 在轉(zhuǎn)錄階段，轉(zhuǎn)錄出 pre-crRNA，隨后 pre-crRNA 被切割產(chǎn)生成熟的 crRNA，每個 crRNA 由針對入侵者的重復(fù)序列和間隔序列組成。c. 在干擾階段，Cas 蛋白直接在與 crRNA 間隔序列互補的位點切割外源核酸。

為了在靶細胞中實現(xiàn)精確的基因組編輯，CRISPR/Cas 系統(tǒng)的核心組件— Cas9 蛋白和導(dǎo)向 RNA (gRNA)，必須有效地進入細胞核。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的遞送主要通過 3 種形式：

• 遞送編碼 Cas9 和 sgRNA 的質(zhì)粒 DNA，如 pX330、pX458 和 pX459 等；
• 遞送 mRNA 和 sgRNA 元件，mRNA 通過在細胞質(zhì)中的翻譯過程轉(zhuǎn)化為 Cas9 核酸酶；
• 遞送RNP (Ribonucleoprotein，Cas9 蛋白和 sgRNA 復(fù)合物) ，此方法繞過了轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，可產(chǎn)生最快的基因編輯效果 (圖 3)。

然而，mRNA 分子的不穩(wěn)定性及易降解性限制了其在基因編輯中的應(yīng)用。同時，將 Cas9 蛋白與效應(yīng)蛋白協(xié)同遞送以實現(xiàn)基因編輯的功能也面臨挑戰(zhàn)。

 

遞送系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化是 CRISPR 技術(shù)的編輯效率提升的關(guān)鍵因素之一。有效、安全地將 CRISPR 組件遞送到目標細胞中，是實現(xiàn)高效基因編輯的前提。

針對目前最熱的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，開發(fā)了很多遞送系統(tǒng),包括物理方法、病毒載體以及非病毒載體。

表 1. CRISPR/Cas9 遞送的物理方法和生物方法^[5]。

 

雖然病毒載體轉(zhuǎn)染效率很高，但是安全性 (如致癌、插入突變和免疫原性) 仍值得注意，且不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。同時，Cas9 質(zhì)粒的大小通常約為 8 kb 或更大，而 AAV 病毒載體包裹質(zhì)粒的大小約為 4.5 kb，LV 病毒載體包裹質(zhì)粒的大小約為 8 kb，嚴重限制了 AAV 病毒載體的應(yīng)用范圍。此外，病毒載體不能準確定位病變部位，常造成正常組織器官損傷,甚至危及患者生命[5]。

因此，基于納米技術(shù)、生物材料、藥劑學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉研究和發(fā)展的非病毒載體更具潛力。特別是在生物安全、裝載和包裹能力方面，非病毒載體在 CRISPR/Cas9 的基因治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景 (表 2)[5]。

表 2. 非病毒載體遞送 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特點及應(yīng)用^[5]。

 

 

▐ 癌癥

癌癥的進展往往伴隨著關(guān)鍵基因表達模式的顯著改變，如腫瘤抑制基因 P53、細胞信號通路關(guān)鍵分子 Notch 以及免疫檢查點分子 PD-L1 等。這些基因的異常表達在腫瘤細胞的生長、侵襲和免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色。同時，腫瘤微環(huán)境的異常變化也對腫瘤細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠影響。

鑒于此，CRISPR 技術(shù)提供了一種潛在的策略，通過基因沉默或過表達來調(diào)控腫瘤細胞中異常表達的基因。

Li 等人構(gòu)建了一種基于金納米棒的低氧響應(yīng)納米顆粒，該納米顆粒攜帶 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向 HSP90α 進行敲除載體進入腫瘤細胞后，Cas9/sgRNA RNP 被釋放到細細胞中，使 HSP90α 沉默，使細胞失去耐熱性，隨后使用 NIR light 進行腫瘤殺滅 (圖 4)。

▐ 心血管疾病

心血管疾病，如動脈粥樣硬化、心肌肥大、心肌梗死和主動脈夾層，構(gòu)成了全球健康的主要威脅。心臟和血管系統(tǒng)具有快速的血流和較高的血壓，這些生理特性要求我們在設(shè)計和開發(fā)針對心血管疾病的納米藥物遞送系統(tǒng)時，必須考慮到血流動力學(xué)的影響，以確保藥物的有效遞送和治療效率。

Schoger 等首先構(gòu)建了 dCas9/VPR 轉(zhuǎn)基因小鼠，將此序列插入肌球蛋白重鏈 Myh6 啟動子后，與 Myh6 協(xié)同轉(zhuǎn)錄。由于 Myh6 是心肌細胞特異性基因，dCas9/VPR 系統(tǒng)的表達只發(fā)生在心肌細胞中。隨后注射攜帶 sgRNA 的 AAV9，激活細胞內(nèi)心肌細胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。
利用此方法獲得了心肌細胞特異性的表達激活系統(tǒng)，并可控制轉(zhuǎn)錄激活的時機，為心血管研究或其他難以直接接觸的器官或組織研究提供了重要參考。

▐ 鐮狀細胞病

鐮狀細胞病由成人血紅蛋白 β-珠蛋白亞基的基因突變引起，導(dǎo)致產(chǎn)生鐮狀血紅蛋白，這種血紅蛋白在缺氧條件下聚合，使紅細胞變形、變硬并易碎，導(dǎo)致微血管阻塞、溶血和炎癥。胎兒血紅蛋白水平的升高可以保護免受鐮狀細胞病并發(fā)癥的影響 (HBG1 和 HBG2 基因編碼 γ-珠蛋白，是胎兒血紅蛋白的組成部分)。

研究人員分別將 72 種不同的 gRNA 分布在 HBG1 和 HBG2 基因的啟動子區(qū)域上。然后，將 Cas9 蛋白與這些 gRNA 復(fù)合體轉(zhuǎn)入健康供體的 CD34+ 細胞，并評估分化后的紅細胞前體細胞中胎兒血紅蛋白免疫染色的紅細胞 (F 細胞) 的比例[2]。

在篩選過程中，發(fā)現(xiàn) gRNA-68 產(chǎn)生的 F 細胞水平最高。三名嚴重鐮狀細胞病患者在接受 CRISPR/Cas9 編輯的 CD34+ 造血干/祖細胞輸注后，紅細胞中胎兒血紅蛋白的穩(wěn)定誘導(dǎo)和疾病嚴重程度的臨床改善。表明 CRISPR-Cas9 對 HBG1 和HBG2 基因啟動子的編輯是一種有效的策略，用于誘導(dǎo)胎兒血紅蛋白的產(chǎn)生[3]。
此外，目前已有多種 CRISPR/Cas 藥物進入到臨床研究 (表 3)[5]。

表 3. CRISPR/Cas 藥物臨床及臨床前研究 (部分)^[5]。 

 

今天給大家盤點了 CRISPR/Cas 技術(shù)，以及各種遞送載體的優(yōu)缺點，主要給大家介紹了 CRISPR/Cas 在疾病中的應(yīng)用，大家可以根據(jù)自己的研究領(lǐng)域選擇合適的 CRISPR/Cas 相關(guān)技術(shù)！

 

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CL4F8-6 可電離的陽離子脂質(zhì), 可攜帶 Cas9 mRNA 和 sgRNA 誘導(dǎo)小鼠體內(nèi) CRISPR 介導(dǎo)的基因敲除。

LZCap AG(3'Acm) Cas9 mRNA 與純化的 sgRNA 一起使用，通過表達的 Cas9 蛋白與sgRNA 一起發(fā)揮切割功能。

BRD0539 CRISPR/Cas9 小分子抑制劑，可有效抑制 SpCas9。

TT3 一種可電離的類脂材料，用于 mRNA 和 CRISPR/Cas9 的遞送。

80-O14B 一種用于 CRISPR/Cas9 遞送的陽離子脂質(zhì)樣化合物。

參考文獻

[1] Liu Z, et al. Recent advances and applications of CRISPR-Cas9 in cancer immunotherapy[J]. Molecular Cancer, 2023, 22(1): 35.

[2] Sharma A, et al. CRISPR-Cas9 editing of the HBG1 and HBG2 promoters to treat sickle cell disease[J]. New England Journal of Medicine, 2023, 389(9): 820-832.

[3] Li T, et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2023, 8(1): 36.

[4] Wang S W, et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer[J]. Molecular cancer, 2022, 21(1): 57.

[5] ZHAO ZX, et al. Delivery and application progresses of CRISPR/Cas gene editing system. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2020, 47(4): 286-299 (in Chinese).