流筆記

周期數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

工欲善其事，必先利其器。漂亮的細(xì)胞周期數(shù)據(jù)離不開性能優(yōu)異的儀器，因此，首先需要通過《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0588-2017》^[1]來評估流式細(xì)胞儀的性能。本文中使用BD的DNA質(zhì)量控制試劑盒，對層浪流式細(xì)胞儀檢測到的DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估。

DN質(zhì)量控制試劑盒內(nèi)容：

🔶 小雞紅細(xì)胞核（CEN）：用于建立測試條件。

CEN試劑經(jīng)過特殊處理，內(nèi)含單個(gè)核、雙聯(lián)體核、三聯(lián)體核和更大的聚集體，用來檢測儀器的線性度和分辨率。經(jīng)PI染色后，由于細(xì)胞核聚集程度的不同，在PI的直方圖中會(huì)出現(xiàn)至少4個(gè)峰，前4個(gè)峰分別代表單個(gè)核、雙聯(lián)體核、三聯(lián)體核和四聯(lián)體核。若染色正常，儀器線性度良好，則四個(gè)峰所在道數(shù)的平均比值接近1:2:3:4。

🔶 小牛胸腺細(xì)胞核（CTN）：具有一個(gè)完整的細(xì)胞周期，且具有細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期，大部分核處于G0/G1期，小部分處于S期和G2/M期。還可作為細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)分析的質(zhì)控。

🔶 2μm的熒光微球：作為一種穩(wěn)定的非生物標(biāo)準(zhǔn)品來確認(rèn)儀器的CV（細(xì)胞離散度），要求儀器CV＜2.3%。

🔶核酸染料碘化丙啶（PI）

圖1：DNA QC試劑盒數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)評估結(jié)果：01

1. 出現(xiàn)明顯7峰，且檢測CEN結(jié)果為（圖1A）PK1:PK2:PK3:PK4:PK5:PK6:PK7 = 1.00:2.00:2.99:3.97:4.94:5.93:6.87 (≈1:2:3:4:5:6:7)。

【行業(yè)要求CEN結(jié)果滿足至少出現(xiàn)4個(gè)峰，且前四個(gè)峰的比值接近1:2:3:4】02

2. CTN檢測結(jié)果為周期擬合G2/G1=2.01（圖1B）。

【行業(yè)要求G2/M與G0/G1的平均熒光強(qiáng)度比值在1.95-2.05之間】03

3. 2μm微球結(jié)果CV=1.75%（圖1C）。

【行業(yè)要求CV＜2.3%】

綜上可得，層浪流式細(xì)胞儀在DNA檢測中表現(xiàn)良好，QC數(shù)據(jù)均遠(yuǎn)超行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，滿足臨床/科研實(shí)驗(yàn)需求，是流式分析細(xì)胞周期的卓越選擇。
 

細(xì)胞周期應(yīng)用場景1、細(xì)胞系

細(xì)胞系是周期實(shí)驗(yàn)研究常用的樣本，如圖2分別依次為A圖：MCF-7乳腺癌細(xì)胞系、B圖：MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系、C圖：HL-7702[L-02;LO2]肝細(xì)胞系。不同細(xì)胞系周期檢測及擬合結(jié)果如下圖所示：

圖2：常見細(xì)胞系自動(dòng)周期擬合

數(shù)據(jù)分析與解讀

1. 三種細(xì)胞系檢測到的CVG1值分別為：

MCF7-1.63%、231-2.09%、LO2-2.93%。

【正常二倍體的CVG1應(yīng)＜8%】

注：G0/G1峰的CV（CVG1）顯著影響S期計(jì)算的準(zhǔn)確性，然而在實(shí)際應(yīng)用中，由于腫瘤樣本會(huì)存在多個(gè)亞群，其CVG1值可能會(huì)偏高，影響結(jié)果。建議將CVG1＜8%的腫瘤樣本用于有用的S期測定。

2. 檢測到的RCS（限制性立方樣條回歸，用來反映樣本的擬合程度）分別為：3.55、2.78、3.70。

【RCS＜3.0，表示擬合良好；RCS在3.0-5.0，被認(rèn)為是基本擬合；RCS＞5.0，表明擬合匹配度差】

2、生殖細(xì)胞

在生殖相關(guān)研究中，生殖細(xì)胞不同時(shí)期百分比的變化一直是研究的重點(diǎn)。以C57BL/6小鼠精囊為例，可以檢測到不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量百分比：亞倍體（sub1N）細(xì)長精子細(xì)胞；單倍體（1N）圓形精子細(xì)胞；二倍體（2N）精原細(xì)胞；四倍體（4N）精原細(xì)胞G2M期。使用層浪流式細(xì)胞儀PI檢測精細(xì)胞周期結(jié)果如圖3所示：

圖3：C57BL/6小鼠精囊周期檢測

數(shù)據(jù)分析與解讀

亞倍體（sub1N）和單倍體（1N）百分比為64.66%、二倍體（2N）百分比為7.52%、四倍體（4N）的百分比為20.84%，與文獻(xiàn)報(bào)道中正常C57BL/6生殖細(xì)胞占比一致。^[2]

3、植物細(xì)胞

植物細(xì)胞的多倍化對于研究個(gè)體生長發(fā)育具有重要的生物學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測植物倍體具有簡單、快速、準(zhǔn)確、直觀等優(yōu)點(diǎn)，在植物學(xué)中有著越來越廣泛的應(yīng)用價(jià)值。模式生物擬南芥是植物倍體研究的經(jīng)典角色，用層浪流式細(xì)胞儀對其葉片倍體進(jìn)行檢測和分析，得到圖4結(jié)果：

圖4：擬南芥葉片周期檢測

數(shù)據(jù)分析與解讀
1.PK1:PK2=1:1.9，接近1:2。
注：植物周期檢測一般不用周期擬合軟件擬合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品確定樣本有單倍體、二倍體、四倍體，或者多倍體。植物可以檢測的樣本有：根、莖、葉、種子、花等。

 總結(jié)一鍵擬合功能示意

層浪流式細(xì)胞儀對DNA QC試劑盒（CEN/CTN/微球）的各項(xiàng)檢測結(jié)果均表現(xiàn)優(yōu)異，表明儀器的性能不僅滿足各類樣本細(xì)胞周期檢測的需求，其檢測結(jié)果更是遠(yuǎn)優(yōu)于行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求，特別是CEN檢測，可以檢測出多個(gè)峰值，且符合倍比關(guān)系。

除此之外，層浪流式細(xì)胞儀分析軟件ModelFlower內(nèi)置細(xì)胞周期分析功能，可以對周期數(shù)據(jù)進(jìn)行一鍵擬合，并有批量分析與批量數(shù)據(jù)導(dǎo)出的功能。

注意事項(xiàng)
· 除去碎片之外，建議可供分析的目的細(xì)胞在1萬以上，雖然細(xì)胞數(shù)據(jù)過大會(huì)影響到分析的速度，但不會(huì)對細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的百分比檢測產(chǎn)生影響，擬合效果反而更好，因此在條件允許的情況下，收集量多多益善。擬合不準(zhǔn)確可以自行調(diào)整嗎？
· 自動(dòng)擬合之后如不滿意結(jié)果，也可以通過手動(dòng)調(diào)整的方式，改變G1和G2門的位置，還可以批量應(yīng)用到其他樣本中以保持一致性。
· 首先，不同細(xì)胞系的擬合效果存在差異。其次，影響周期擬合效果的因素還有：試劑盒差異、細(xì)胞固定方式的影響、收集細(xì)胞量的差異、人為操作影響等。因此，為了盡量減少差異，操作標(biāo)準(zhǔn)要規(guī)范，最大程度上避免操作誤差。|流筆

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0588-2017,流式細(xì)胞儀.國家食品藥品監(jiān)督管理局.2017.

[2]R.B. Struijk,1 C.M. De Winter-Korver,1 S, Simultaneous Purifification of Round and Elongated Spermatids from Testis Tissue Using a FACS-Based DNA Ploidy Assay，International Society for Advancement of Cytometry.

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