胰腺癌是一種預后極差的惡性腫瘤，對全球健康造成重大挑戰(zhàn)。這種癌癥的發(fā)病率逐年上升，但目前的治療選擇很有限。腫瘤微環(huán)境（TME）在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其特點是廣泛纖維化，且存在癌癥相關成纖維細胞（CAF）。CAF調節(jié)胰腺癌的發(fā)病過程，包括腫瘤生長、免疫逃逸和耐藥性等。因此，靶向調節(jié)CAF是提高胰腺癌療效的一種潛在策略。

細胞外囊泡（EV）經過改造，可將治療劑（如遺傳物質或藥物）輸送到目標位點，故引起了科學界的廣泛興趣。來源于骨髓間充質干細胞的細胞外囊泡（BMSC-EV）既具有EV的優(yōu)勢，又具有BMSC的相關特性，安全性高，在腫瘤發(fā)展過程中可被招募到TME并分化成CAF。因此，BMSC-EV是一種大有前景的胰腺癌治療方法，有望破壞CAF和癌細胞之間的對話，逆轉纖維化的TME，并改善治療效果。

近日，南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院張業(yè)偉教授領導的研究團隊發(fā)現，工程化細胞外囊泡可以實現對CAF的靶向重編程，進而調控胰腺癌的腫瘤微環(huán)境。這項研究成果于2024年6月24日發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志（IF = 40.8）上，有望提高現有化療方案的療效，改善胰腺癌患者的預后。
 

圖片來源：《Signal Transduction and Targeted Therapy》
（https://doi.org/10.1038/s41392-024-01872-7）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構建了以胰腺CAF為靶點的工程化細胞外囊泡（IEVs-PFD/138）。他們利用雙熒光素酶報告實驗和免疫共沉淀實驗分析了miR-138-5p的作用機制。他們接著通過2D的細胞實驗以及3D的多細胞腫瘤球狀體實驗和皮下異種移植模型，研究了IEVs-PFD/138對胰腺CAF靶向重編程的影響。最后，他們還利用C-NKG小鼠（由賽業(yè)生物提供，產品編號：C001316）構建了患者來源的異種移植（PDX）模型，并和胰腺癌原位小鼠模型研究了IEVs-PFD/138和吉西他濱的聯合治療效果。

技術路線
01 構建以胰腺CAF為靶點的工程化細胞外囊泡IEVs-PFD/138并表征其特征
02 確定miR-138-5p的目標基因，分析其在CAF中的作用機制
03 通過體外和體內分析研究IEVs-PFD/138對腫瘤生長和藥物遞送的影響
04 利用PDX模型和胰腺癌原位模型研究IEVs-PFD/138和吉西他濱的聯合治療效果

研究結果
1. IEVs-PFD/138的制備和表征
研究人員利用miRNA芯片比較了胰腺CAF和健康成纖維細胞（NF）之間的差異表達miRNA，發(fā)現miR-138-5p在兩者之間差異較大。與NF相比，CAF中的miR-138-5p表達下調。在建立永生化的CAF細胞系后，他們發(fā)現miR-138-5p模擬物可降低CAF的增殖率和遷移率。由此可見，miR-138-5p可對CAF的表型進行重編程，且在胰腺CAF中的表達下調。

接下來，研究人員構建了以胰腺CAF為靶點的工程化細胞外囊泡。他們在來源于BMSC的EV中加入miR-138-5p模擬物和抗纖維化藥物吡非尼酮（PFD），并用整合素α5靶向肽對其進行表面修飾，構建出IEVs-PFD/138（圖1）。Western blot、透射電鏡和納米顆粒追蹤分析證實了IEVs-PFD/138的各種特性。
 

圖1 IEVs-PFD/138的制備和表征^[1]

之后他們檢驗了工程化IEVs的CAF靶向能力。與非靶向EVs相比，CAF對IEVs的吸收率更高。同樣地，與IEVs-138共同孵育的CAF中的熒光信號高于與EVs-138共同孵育的CAF，證實整合素α5靶向肽提高了CAF靶向能力。在皮下纖維化胰腺癌模型中，IEVs的靶向能力高于未修飾的EVs。IEVs發(fā)出的熒光信號明顯更高，表明IEVs到達胰腺癌部位的能力增強。

2. miR-138-5p在CAF中的功能機制
為了闡明miR-138-5p在CAF中的作用機制，研究人員在挖掘數據庫后鎖定了與CAF相關性最強的FERMT2。雙熒光素酶報告實驗的結果表明，miR-138-5p與FERMT2存在直接的相互作用。他們發(fā)現，FERMT2的表達與CAF的增殖和遷移呈正相關。在胰腺癌細胞群中，FERMT2表達量最高的是CAF，其次是癌細胞，表明該基因在腫瘤-基質相互作用和TME中發(fā)揮潛在作用。此外，FERMT2的病理評分與胰腺癌患者的臨床分期呈正相關。

免疫共沉淀分析表明，FERMT2與TGFBR1發(fā)生相互作用。miR-138-5p直接抑制了FERMT2-TGFBR1復合物的形成，從而抑制了TGF-β信號通路的激活。此外，FERMT2還與膠原蛋白形成通路呈正相關，而PYCR1這種酶參與了脯氨酸代謝，調節(jié)膠原蛋白的沉積。分析發(fā)現miR-138-5p通過直接靶向FERMT2-PYCR1復合物，抑制了脯氨酸介導的膠原蛋白合成。

3. IEVs-PFD/138處理抑制了CAF的促腫瘤作用
體外分析表明，IEVs-PFD/138抑制了FERMT2-TGFBR1和FERMT2-PYCR1復合物的形成，并抑制了CAF中促炎因子和促腫瘤發(fā)生因子的產生。通過調節(jié)CAF中的脯氨酸代謝，IEVs-PFD/138還降低了細胞內的脯氨酸含量。此外，將EV處理后的CAF的條件培養(yǎng)基與胰腺癌細胞PANC-1共同培養(yǎng)后，研究人員發(fā)現IEVs-PFD/138能夠高效抑制PANC-1細胞增殖、遷移和侵襲（圖2）。

胰腺癌的TME中存在致密的細胞外基質，讓抗癌療法很難滲透。為了應對這一挑戰(zhàn)，他們將PANC-1細胞與CAF共同培養(yǎng)，建立了富含基質的3D多細胞腫瘤球狀體模型。在IEVs-PFD/138處理后，熒光探針滲透性增加，3D腫瘤球狀體明顯縮小，并在球狀體周圍觀察到壞死細胞（圖2）。這些結果表明，IEVs-PFD/138可通過抑制纖維化基質的形成和改善藥物遞送，增強小分子抗腫瘤藥物在胰腺癌TME中的療效。

為了研究IEVs-PFD/138在體內的治療意義和機制，研究人員通過聯合移植PANC-1細胞和CAF，建立了小鼠皮下胰腺癌模型，并在小鼠靜脈中注射EVs，進行7個周期的治療。結果表明，IEVs-PFD/138表現出明顯的抗腫瘤效果，顯著延長了裸鼠的存活時間。后續(xù)分析發(fā)現，IEVs-PFD/138處理能夠抑制腫瘤細胞增殖和TGF-β信號通路，逆轉CAF的激活，減少膠原蛋白的沉積，并且不會對重要器官產生毒性作用，表明這是一種很有前景的胰腺癌治療策略。
 

圖2 IEVs-PFD/138可逆轉CAF表型、抑制癌細胞并增強藥物滲透^[1]
 

4. IEVs-PFD/138和GEM在多個癌癥模型中的聯合治療效果
之后，研究人員又利用C-NKG小鼠（由賽業(yè)生物提供）構建了患者來源異種移植（PDX）模型，并研究了IEVs-PFD/138和吉西他濱（GEM，一種化療藥物）的聯合治療效果（圖3）。IEVs-PFD/138和GEM聯合治療組的腫瘤生長速度最慢，且腫瘤重量最輕。此外，IEVs-PFD/138能夠有效減少腫瘤基質的生成，促進GEM向腫瘤細胞的遞送，表明它有可能協同增強了GEM在PDX模型中的治療效果。通過抑制TGF-β通路，IEVs-PFD/138還逆轉了CAF的激活。另外，IEVs-PFD/138處理后，缺氧誘導因子HIF1A表達下調，而核苷轉運蛋白ENT1表達增加，促進了細胞內GEM的積累，并改善了治療反應（圖3）。
 

圖3 IEVs-PFD/138在患者來源異種移植胰腺癌模型中的治療效果^[1]

研究人員最后還建立了胰腺癌原位小鼠模型，以便全面反映腫瘤生物學和治療反應。他們在小鼠靜脈中依次注射IEVs-PFD/138和GEM，進行7個周期的治療。他們發(fā)現，GEM和IEVs-PFD/138的聯合使用可顯著抑制腫瘤生長。與對照組相比，聯合治療組的腫瘤體積最小，且小鼠均未發(fā)生腹膜轉移。此外，IEVs-PFD/138促使CAF失活并抑制膠原蛋白分泌，降低了膠原蛋白含量。GEM能降低胰腺癌細胞的遷移能力，而IEVs-PFD/138的加入進一步增強了這種效果，與觀察到的腹膜轉移減少一致。

研究結論
這項研究展示了一種利用工程化EVs（IEVs-PFD/138）治療胰腺癌的新方法。除了增強治療藥物的滲透性外，這種方法還直接抑制了CAF的腫瘤促進作用。IEVs-PFD/138與標準化療藥物GEM的聯合治療效果令人鼓舞，在小鼠模型中顯示出抑制腫瘤生長和轉移的協同效應。這種基于工程化EVs的策略為胰腺癌的治療提供了新思路，有望改善胰腺癌患者的預后和生活質量。

參考文獻：
[1]Zhou, P., Du, X., Jia, W. et al. Engineered extracellular vesicles for targeted reprogramming of cancer-associated fibroblasts to potentiate therapy of pancreatic cancer. Sig Transduct Target Ther 9, 151 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01872-7