近日，成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院王軍蒙助理研究員（第一作者），吳巧鳳研究員（通訊作者）團(tuán)隊(duì)在CNS Neuroscience & Therapeutics雜志在線發(fā)表了題為“Peripheral inflammation triggering central anxiety through the hippocampal glutamate metabolized receptor 1 ”的研究論文，作者通過(guò)建立DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)腸道炎癥與焦慮行為密切相關(guān)，并通過(guò)行為學(xué)測(cè)試證實(shí)了DSS處理顯著提高小鼠焦慮水平。作者還使用TLR4抑制劑TAK-242減輕炎癥，發(fā)現(xiàn)小鼠的焦慮行為得到改善。接著，研究團(tuán)隊(duì)利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）分析揭示結(jié)腸炎模型小鼠海馬體中谷氨酸突觸過(guò)度活躍導(dǎo)致興奮/抑制失衡，下調(diào)海馬體GRM1表達(dá)可恢復(fù)海馬谷氨酸突觸興奮/抑制平衡，從而減輕小鼠的焦慮樣行為。研究成果揭示了外周炎癥通過(guò)海馬體谷氨酸突觸和GRM1的過(guò)度激活誘發(fā)焦慮，為潰瘍性結(jié)腸炎伴發(fā)焦慮的中樞機(jī)制提供了新見(jiàn)解。

為探討潰瘍性結(jié)腸炎（UC）與焦慮之間的關(guān)系，作者構(gòu)建了結(jié)腸炎小鼠模型，并通過(guò)曠場(chǎng)測(cè)試（OFT ）和高架十字迷宮（EPM）檢測(cè)了外周炎癥致焦慮作用（圖 1A）。結(jié)果表明，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組小鼠相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠在中心區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間（圖 1B、C），進(jìn)入中心區(qū)域的頻率（圖 1D）、直立時(shí)間（圖 1E）和次數(shù)（圖 1F）有所減少。EPM 結(jié)果顯示，DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠在開(kāi)臂的停留時(shí)間（圖 1G、H）、進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)顯著降低（圖 1I）。這些結(jié)果表明給與DSS顯著增加了小鼠的焦慮樣行為。

圖1：DSS 誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為的產(chǎn)生

 

進(jìn)一步通過(guò)腹腔注射TAK-242（一種TLR-4的選擇性抑制劑），觀察抑制炎癥是否可以改善結(jié)腸炎小鼠的焦慮樣行為。發(fā)現(xiàn)與DSS+Vehicle組相比，不同劑量的TAK-242（5mg/kg和10mg/kg）顯著抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短和體重的減輕，并改善了DAI評(píng)分。并且，與5mg/kg組相比，10mg/kg組對(duì)結(jié)腸炎有更明顯的改善作用。更重要的是，與 DSS + Vehicle小鼠相比，TAK-242 顯著減輕了結(jié)腸炎小鼠的焦慮樣行為，正如行為學(xué)結(jié)果反映，小鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域的停留時(shí)間（圖2A-D）、直立時(shí)間（圖2E）、直立次數(shù)（圖2F）以及在EPM 中開(kāi)臂的時(shí)間增加（圖2H-J）。

 

圖2：TAK-242改善小鼠的焦慮樣行為

 

海馬與中樞炎癥調(diào)控及情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究結(jié)腸炎小鼠海馬體的變化，作者對(duì)UC小鼠腦空間轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行了研究。從對(duì)照組和DSS組腦組織的兩個(gè)ST數(shù)據(jù)集中，總共獲得了覆蓋組織樣本的5731個(gè)捕獲位點(diǎn)（對(duì)照，2994 spots；DSS，2737 spots），對(duì)應(yīng)于總共18個(gè)簇（Cluster）。

 

圖S3：海馬空間轉(zhuǎn)錄組

 

作者根據(jù)簇與大腦解剖結(jié)構(gòu)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系獲得了每個(gè)樣本的海馬體spots，并將Cluster 6、11和13共同定義為海馬體(圖3A-B)，隨后通過(guò)與已發(fā)表的成年小鼠大腦分子圖譜（MAMB ）對(duì)齊驗(yàn)證了大腦區(qū)域劃分的準(zhǔn)確性（圖 3C、圖 S5）。與作者的研究結(jié)果一致，MAMB（圖S6）顯示W(wǎng)ipf3、Hpca和Ddn在整個(gè)海馬中高表達(dá)，而cluster 6（Itpka、Fibcd1、Spink8）、11（Cabp7、Homer3、Hs3st4）和13（C1ql2、Fam163b、Dsp）的標(biāo)記基因分別在 CA1、CA3 和 DG 區(qū)域具有特異性。這些結(jié)果表明作者團(tuán)隊(duì)建立了可靠的海馬空間基因表達(dá)譜，可用于后續(xù)的差異分析。

 

 

圖3：空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示結(jié)腸炎小鼠海馬谷氨酸突觸信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活。

 

圖S5：海馬的聚類(lèi)分析

 

作者使用edgeR軟件在海馬區(qū)域鑒定了235個(gè)差異表達(dá)基因，其中212個(gè)基因在DSS組上調(diào)。功能分析表明這些上調(diào)基因主要富集在膜去極化、突觸傳遞和谷氨酸能等生物學(xué)進(jìn)程�？紤]到中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸平衡與行為的關(guān)系，作者進(jìn)一步分析了海馬組織中谷氨酸和GABA能突觸的評(píng)分。結(jié)果顯示，DSS 組的海馬谷氨酸能突觸信號(hào)顯著激活（圖 4A-B，E），而 GABA 能突觸信號(hào)在兩組之間沒(méi)有差異（圖 4C-D，F(xiàn)）。根據(jù) GSVA 得分中位數(shù)，將每個(gè)點(diǎn)分為高谷氨酸能/ GABA能和低谷氨酸能/ GABA 能四類(lèi)，并計(jì)算它們?cè)趦山M中的比例。DSS組中高谷氨酸能點(diǎn)的比例（68.3%）是CON組（32.3%）的兩倍多，而DSS組中高GABA能點(diǎn)的比例（56.6%）僅比CON (43.6%) (圖 4G, H)組高13%。然后作者將高谷氨酸能點(diǎn)和低GABA能點(diǎn)定義為興奮性spot；反之亦然作為抑制性spot。結(jié)果顯示，DSS組興奮性spot比例幾乎是CON組的兩倍，且增加的興奮性spot廣泛分布在整個(gè)海馬區(qū)，包括CA1、CA3和DG（圖4I）。這些結(jié)果表明海馬興奮/抑制失衡是外周炎癥誘發(fā)焦慮的潛在重要機(jī)制，谷氨酸突觸信號(hào)過(guò)度激活主要介導(dǎo)該過(guò)程。
 

 

圖4：海馬體的興奮/抑制失衡是由谷氨酸突觸信號(hào)傳導(dǎo)異常激活介導(dǎo)的
 

接著，作者檢查了兩組之間谷氨酸突觸信號(hào)傳導(dǎo)中核心差異基因的表達(dá)特征。在top差異基因中（倍數(shù)變化≥1.5）（圖5A），Grm1和Shank3（Src同源性3和多個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域3）具有與谷氨酸突觸信號(hào)傳導(dǎo)相似的空間差異表達(dá)模式（圖5B）。由于大量研究報(bào)告GRM1在各種動(dòng)物模型中誘發(fā)焦慮樣行為，研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了海馬體中Grm1的表達(dá)。RT-qPCR（圖5C）和IF（圖5D）結(jié)果顯示Grm1在結(jié)腸炎小鼠的海馬中顯著上調(diào)，表明它可能是外周炎癥誘導(dǎo)的焦慮樣行為的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 ：GRM1 是增強(qiáng)結(jié)腸炎小鼠谷氨酸突觸信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子

 

為驗(yàn)證此假說(shuō)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了三種 shRNA并將它們克隆到腺相關(guān)病毒載體中以干擾模型小鼠海馬Grm1表達(dá)，以及對(duì)焦慮樣行為的影響。在HEK 293細(xì)胞中確定干擾效率更高的候選shRNA2后，在 DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型前3周將 AAV-Grm1-shRNA注射到海馬中（圖 6A）。待確定了病毒對(duì)海馬GRM1的抑制作用后（圖6B-C），檢測(cè)了AAV-Grm1-shRNA對(duì)焦慮樣行為的影響。結(jié)果表明，與結(jié)腸炎小鼠相比，AAV-Grm1-shRNA組在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中顯著增加了小鼠中心區(qū)域的停留時(shí)間、進(jìn)入中心區(qū)域的頻率、直立時(shí)間和直立次數(shù)（圖 6D-G）。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，AAV-Grm1-shRNA組進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間和進(jìn)入頻率（圖6H-I）也明顯增加。更重要的是，TAK-242顯著逆轉(zhuǎn)了DSS誘導(dǎo)小鼠海馬GRM1的上升趨勢(shì)（圖6J，K）。

圖6：海馬AAV-Grm1-shRNA注射改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的焦慮樣行為 

 

圖7：海馬GRM1介導(dǎo)DSS結(jié)腸炎小鼠焦慮樣行為

 

該研究通過(guò)建立DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型，并采用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和病毒干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠的海馬區(qū)存在谷氨酸突觸的過(guò)度激活誘發(fā)的興奮性/抑制性失衡。此外，研究還發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)的谷氨酸代謝受體GRM1是炎癥誘導(dǎo)焦慮樣行為的關(guān)鍵分子。該研究不僅揭示了腸道炎癥與焦慮之間的雙向腦腸聯(lián)系，還為治療結(jié)腸炎相關(guān)的精神或情緒異常提供了新的見(jiàn)解和策略。

 

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