MADS轉(zhuǎn)錄因子的同源蛋白SEPALLATA3 (SEP3)和AGAMOUS (AG)是調(diào)控?cái)M南芥花發(fā)育分化的重要DNA結(jié)合蛋白。在雌蕊發(fā)育階段，SEP3和AG形成異源四聚體，通過識(shí)別CArG-box序列來調(diào)控基因的表達(dá)。Seq-DAP-seq技術(shù)與ChIP-seq聯(lián)合使用，可用于分析轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域與基因組的互作。

2020年發(fā)表在Nucleic Acids Research上的“Genome-wide binding of SEPALLATA3 and AGAMOUS complexes determined by sequential DNA-affinity purification sequencing”文章，發(fā)現(xiàn)MADS-TFs多聚化類型影響DNA結(jié)合域蛋白的全基因組結(jié)合模式和靶基因的表達(dá)。文章開發(fā)了一種seq-DAP-seq技術(shù)用于轉(zhuǎn)錄因子與全基因組的互作研究，并結(jié)合RNA-seq技術(shù)檢測(cè)靶基因表達(dá)。

研究首先構(gòu)建了三種質(zhì)粒分別表達(dá)三種多聚體蛋白，分別為SEP3同源二聚體（純化標(biāo)簽為3×FLAG）、SEP3-AG異源四聚體（純化標(biāo)簽為3×FLAG和5×MyC）和SEP3^Δtet-AG異源二聚體（純化標(biāo)簽為3×FLAG和5×MyC）。使用多標(biāo)簽順序純化的方式分離異源多聚體蛋白（Figure 1. A）。這種方法可篩選出MADS復(fù)合體用于DNA親和純化測(cè)序。所有DAP-seq和seq-DAP-seq實(shí)驗(yàn)均使用擬南芥Col-0基因組DNA文庫進(jìn)行。研究通過統(tǒng)計(jì)SEP3、SEP3^Δtet-AG和SEP3-AG的共有峰和特定峰來分析他們的全基因組結(jié)合位點(diǎn)（Figure 1. C-F）。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）進(jìn)行建模，發(fā)現(xiàn)這些不同的復(fù)合物具有高度相似的CArG-box序列（Figure 2）。

研究比較了SEP3-AG異源四聚體和SEP3^Δtet-AG異源二聚體的seq-DAP-seq數(shù)據(jù)，結(jié)果表明與SEP3^Δtet-AG相比，SEP3-AG具有更高的DNA結(jié)合親和力和豐富的CArG-box結(jié)合空間位置（Figure 4. A-B）。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，研究使用KNUCKLES (KNU)啟動(dòng)子生成了不同間距DNA片段的KNU啟動(dòng)子CArG-box結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行EMSAs檢測(cè)分析。結(jié)果表明，四聚化不僅允許獲得不同的結(jié)合模式，而且與具有強(qiáng)間隔偏好的雙位點(diǎn)結(jié)合，而二聚體優(yōu)先結(jié)合單個(gè)高親和力位點(diǎn)，但不能與較低親和力的二級(jí)位點(diǎn)相互作用。

研究比較了Seq-DAP-seq（體外）與ChIP-seq（體內(nèi)）檢測(cè)中的AG、SEP3或前兩者都包含的結(jié)合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)seq-DAP-seq和ChIP-seq結(jié)合區(qū)域相關(guān)的基因之間有顯著的重疊（Figure 5. A-C），進(jìn)而確定了受調(diào)控的靶點(diǎn)。研究通過比較突變體花序分生組織RNA-seq數(shù)據(jù)，獲得了受SEP3調(diào)控的基因。研究發(fā)現(xiàn)SEP3-AG靶標(biāo)的seq-DAP-seq和ChIP-seq具有高度重疊，與AG和/或SEP3相比差異表達(dá)基因（DEGs）比例顯著，表明能夠通過seq-DAP-seq識(shí)別那些在體內(nèi)被SEP3-AG復(fù)合物結(jié)合和調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究還發(fā)現(xiàn)了僅在seq-DAP-seq中而不在ChIP-seq中的結(jié)合位點(diǎn)，表明他們是SEP3-AG復(fù)合物的新靶點(diǎn)。

seq-DAP-seq具有純化轉(zhuǎn)錄因子（TF）復(fù)合物和直接定位于基因組DNA的優(yōu)勢(shì)，可確定特定TF復(fù)合物（SEP3-AG異源四聚體）的潛在全基因組結(jié)合位點(diǎn)。seq-DAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)的組合，能夠鑒定出ChIP-seq實(shí)驗(yàn)中可能不存在的已知和潛在的新直接靶標(biāo)。與ChIP-seq相比，seq-DAP-seq可以在單堿基水平上檢測(cè)基因組結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)間距，從而提高TF-DNA互作檢測(cè)的準(zhǔn)確性。