本文要點：近紅外 I/II 熒光蛋白 （NIR-I/II FPs） 對于體內(nèi)成像至關(guān)重要，但目前的 NIR-I/II FP 面臨著包括稀缺性、發(fā)色團(tuán)成熟要求和發(fā)射波長有限（通常< 800 nm）等挑戰(zhàn)。在這里，我們利用合成蛋白質(zhì)尋求的 NIR-II 染料作為發(fā)色團(tuán)，通過位點特異性親核取代反應(yīng)與標(biāo)簽蛋白（例如人血清白蛋白、HSA）共價結(jié)合，從而創(chuàng)建概念驗證仿生 NIR-II FP。這種化學(xué)蛋白尋找策略可以在溫和的生理條件下完成，無需催化。蛋白質(zhì)組學(xué)分析可識別特異性結(jié)合位點（DIII上的Cys 477）。NIR-II FP顯著增強了發(fā)色團(tuán)的亮度和光穩(wěn)定性，同時提高了生物相容性，從而實現(xiàn)了高性能的NIR-II淋巴造影和血管造影。該策略具有通用性，適用于創(chuàng)建各種光譜分離的NIR-I/II FP，用于實時可視化多個生物事件�？傮w而言，這種簡單的仿生方法有可能改變基于熒光蛋白的生物成像，并使原位白蛋白靶向能夠產(chǎn)生用于活生物體深層組織成像的NIR-I/II FP。

 

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本文成功地設(shè)計并構(gòu)建了一個仿生NIR-II熒光蛋白系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用趨化蛋白質(zhì)尋求染料（例如，NIR-II CO-1080和其他NIR-I/II染料）作為發(fā)色團(tuán)，其通過親核取代反應(yīng)共價結(jié)合到蛋白質(zhì)（例如，人血清白蛋白，HSA）的疏水腔中的半胱氨酸。本文的仿生NIR-II FPs能夠通過簡單的靜脈注射對血管和淋巴系統(tǒng)的生理和病理狀況進(jìn)行無創(chuàng)、準(zhǔn)確的NIR-II可視化，極大地促進(jìn)了術(shù)中成像指導(dǎo)的手術(shù)和術(shù)后無創(chuàng)監(jiān)測。利用獨特的1064 nm最佳激發(fā)NIR-II熒光粉，結(jié)合808nm激發(fā)實現(xiàn)生物事件的多色成像的NIR-I FPs。這項工作為仿生NIR-I/II FPs提供了概念驗證，有效地克服了NIR-FPs的現(xiàn)有局限性，并有可能實現(xiàn)NIR-II生物成像的真正優(yōu)勢。

從仿生學(xué)的角度，本文提出了一種用于構(gòu)建 NIR-II FP 的化學(xué)選擇性蛋白質(zhì)搜索策略。CO-1080通過超分子相互作用進(jìn)入蛋白質(zhì)口袋，并通過蛋白質(zhì)中的-SH基團(tuán)和CO-1080中的Cl-C鍵之間的親核取代反應(yīng)進(jìn)行共價結(jié)合（稱為 “蛋白質(zhì)尋找策略”）。在檢查的三種蛋白質(zhì)中，HSA@CO-1080 FPs表現(xiàn)出最佳的NIR-II發(fā)光能力，熒光增強高達(dá)22.13倍（圖1b–d ）。

為了更好地了解不同蛋白質(zhì)與NIR-II發(fā)色團(tuán)的結(jié)合機制，進(jìn)行了基于滑行程序的非共價分子對接模擬（圖1e-g）。結(jié)果表明，HSA和CO-1080發(fā)色團(tuán)的對接分?jǐn)?shù)最好，結(jié)合能最高。HSA可以有效地限制CO-1080的自由扭曲，并最大限度地減少非輻射躍遷引起的能量耗散，從而現(xiàn)出最佳的NIR-II發(fā)光能力。

接下來，SDS-PAGE凝膠電泳表明，BSA@CO-1080和HSA@CO-1080 FP在相應(yīng)的分子量下都顯示出明亮的熒光帶，驗證了與CO-1080染料的相當(dāng)和高效的共價結(jié)合（圖1）。高分辨率質(zhì)譜（HRMS）也證實了CO-1080與相應(yīng)蛋白質(zhì)之間的共價結(jié)合，同時突出了HSA與CO-1080之間的最佳共價結(jié)合效率。HSA蛋白是CO-1080標(biāo)記/靶向的最佳候選蛋白，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定明亮的NIR-II熒光蛋白。

HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激發(fā)下表現(xiàn)出最顯著的熒光強度，約為980 nm激發(fā)的2.97倍，是808 nm激發(fā)的20.36倍左右。即使在 1500 nm 成像窗口下成像時>HSA@CO-1080 FP 仍保持發(fā)光。熒光光譜和一系列體外穿透實驗證實，HSA@CO-1080 FP在1064 nm激發(fā)下表現(xiàn)出顯著的NIR-II亮度和穿透深度（圖1）

 

圖2. 使用HSA@CO-1080 FP的高性能NIR-II淋巴造影和血管造影

 

本文研究了 HSA@CO-1080 FP 進(jìn)行 NIR-II 淋巴造影的能力。HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激發(fā)下表現(xiàn)出優(yōu)越的淋巴結(jié)定位和淋巴管劃定，優(yōu)于游離CO-1080發(fā)色團(tuán)。值得注意的是，HSA@CO-1080 FPs在>1500 nm成像窗口保持了出色的淋巴成像能力， 與臨床ICG相比，HSA@CO-1080 FPs也顯示出顯著優(yōu)越的NIR-II淋巴成像能力和更長的時間窗口。NIR-II FPs隨后成功應(yīng)用于圖像引導(dǎo)的淋巴結(jié)精確解剖和淋巴水腫疾病的高質(zhì)量可視化（圖2b，c）�？偠�言之，HSA@CO-1080 FP 是下一代 NIR-II 淋巴造影的主要候選者，解決了臨床ICG 淋巴造影的缺陷/局限性。

 

血管對于輸送營養(yǎng)和維持全身器官的正常功能至關(guān)重要。高質(zhì)量的血管造影可以幫助外科醫(yī)生更有效地識別各種器官的血管病變并評估術(shù)后血流恢復(fù)情況。因此，我們對HSA@CO-1080 FP進(jìn)行了一系列臨床前血管造影研究。如圖所示。2d–f、HSA@CO-1080 FP 與 CO-1080 發(fā)色團(tuán)相比，表現(xiàn)出卓越的全身和局部（腿部）血管 NIR-II 成像能力。將成像窗口切換到更長的波長，進(jìn)一步提高了成像質(zhì)量，特別是在>1400 nm和 > 1500 nm 成像窗口中，幾乎沒有皮膚/背景信號干擾。此外，1064 nm 激發(fā)實現(xiàn)了更突出的組織穿透深度和空間分辨率，進(jìn)一步突出了 HSA@CO-1080 FP 優(yōu)于 CO-1080 染料的優(yōu)勢。正如預(yù)期的那樣，HSA@CO-1080 FPs可以實現(xiàn)對血管的多/長期監(jiān)測，不受任何皮膚信號的明顯干擾，這也充分證實了HSA@CO-1080 FPs長期檢測/追蹤血管相關(guān)疾病的能力。

 

由于血管夾層的多樣性和穿支皮瓣設(shè)計的復(fù)雜性，術(shù)后灌注下常導(dǎo)致缺血缺氧引起的局部壞死，使皮瓣壞死成為皮瓣手術(shù)最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。不幸的是，目前還沒有合適的成像技術(shù)來準(zhǔn)確和無創(chuàng)地監(jiān)測皮瓣功能。HSA@CO-1080 FP 成功地在術(shù)后對改良的穿支皮瓣模型進(jìn)行了高對比度的實時監(jiān)測，以模擬臨床皮瓣移植。與正常大鼠不同，HSA@CO-1080 FPs能夠清晰地顯示皮瓣模型的術(shù)后恢復(fù)情況，并準(zhǔn)確定位缺血性壞死區(qū)域（圖2g）.靜脈注射HSA@CO-1080 FPs，仔細(xì)觀察皮瓣區(qū)域的血路，發(fā)現(xiàn)兩條預(yù)留的臀下動脈（IGA）穿支血管先亮起，然后逐漸向上擴(kuò)散。與建模前的成像結(jié)果相比，皮瓣模型組觀察到阻塞血管的打開和血運重建（圖2h）。由于背景信號低和排泄快（能夠重復(fù)觀察），HSA@CO-1080 FP成功地可視化了整個皮瓣模型的進(jìn)展。NIR-II成像證實，進(jìn)展大致可分為三個階段：術(shù)后第2天，遠(yuǎn)端皮瓣出現(xiàn)明顯腫脹，轉(zhuǎn)為深紫色，并開始出現(xiàn)缺血性壞死。術(shù)后第4天，遠(yuǎn)端皮瓣壞死區(qū)加重，呈深褐色。術(shù)后第7天，遠(yuǎn)端皮瓣出現(xiàn)黑色結(jié)痂，伴有干性壞死，與近端有明顯的分界。 HSA@CO-1080 FPs共同具有優(yōu)異的NIR-II血管造影能力，可促進(jìn)NIR-II熒光成像技術(shù)的早期臨床轉(zhuǎn)化，并提供一種無創(chuàng)有效的監(jiān)測皮瓣功能的方法。

 

實時多通道NIR-I/II成像系統(tǒng)可同時記錄多個事件，可洞察疾病發(fā)生機制，提高成像效率，具有較高的體內(nèi)和臨床適用性。多種生物事件的集成熒光成像依賴于非串?dāng)_熒光探針。本文構(gòu)建了仿生NIR-I FP（HSA@IR-808和β-LG@IR-780），并將它們與NIR-II FP（HSA@CO-1080和DIII@CO-1080）相結(jié)合（圖3a）。合成的NIR-I和NIR-II FP分別在808 nm和1064 nm激發(fā)下實現(xiàn)了非重疊發(fā)射，提供了優(yōu)異的雙色成像潛力（圖3b–d）。隨后，使用NIR-I和NIR-II FP進(jìn)行了一系列體內(nèi)多通道生物成像實驗。首先，使用HSA@IR-808 FP和HSA@CO-1080 FPs成功實現(xiàn)了集成的多通道NIR-II淋巴成像（圖3e-g）. 這些NIR-I/II FPs成功地實現(xiàn)了腫瘤浸潤前哨淋巴結(jié)的精確共定位，從而指導(dǎo)術(shù)中有效的手術(shù)切除（避免不必要的切除）（圖3f，g）。使用 HSA@IR-808 FP 和 HSA@CO-1080 FP 也實現(xiàn)了無串?dāng)_的血管和淋巴系統(tǒng)的集成 NIR-II 生物成像（圖3h），這對于精確的成像引導(dǎo)手術(shù)很重要。HSA@CO-1080 FPs（肝膽排泄）和 β-LG@IR-780 FPs（腎排泄）的組合可以同時可視化兩種藥代動力學(xué)途徑，而不會出現(xiàn)串?dāng)_問題。綜上所述，基于仿生策略構(gòu)建的NIR-I/II熒光蛋白具有出色的多色生物成像應(yīng)用潛力，有望實現(xiàn)多種生物事件的綜合實時成像，更好地輔助臨床醫(yī)生處理復(fù)雜疾病。

圖3. 用于多色活體成像的仿生NIR-I/II FP

 

鑒于仿生熒光蛋白具有出色的雙色成像特性，下一個目標(biāo)是擴(kuò)展成像功能以包括其他顏色。為此，我們選擇了HSA@Cy5，β-LG@IR-780 FPs，REMP（NaYbF4：Ce， Er@NaYF4：Gd、Yb@PAA） 和 HSA@CO-1080 FP 作為多色生物成像的候選者。體外成像和紫外吸收/熒光數(shù)據(jù)一致證實，4種選定的探針符合四色成像條件，在最合適的激發(fā)/發(fā)射通道下，可以實現(xiàn)明亮的發(fā)光和最小的串?dāng)_干擾. 我們進(jìn)一步驗證了這些探針的多色體內(nèi)成像能力。(圖3j)。靜脈注射β-LG@IR-780 FP，然后胃內(nèi)注射 RENP 和腹腔注射 HSA@Cy5，最后靜脈注射 HSA@CO-1080 FP。四個通道（660 nm Ex、808 nm Ex、980 nm Ex 和 1064 nm Ex）的相對熒光信號貢獻(xiàn)有助于確定每個探針的生物分布，與每個相應(yīng)單通道中可視化的圖像一致�？傮w而言，NIR-I/II FP的加入使NIR四色體內(nèi)實時生物成像成為現(xiàn)實，有望更好地了解生物體的奧秘和疾病的機制。
 
結(jié)論
本文展示了一種用于開發(fā)近紅外熒光蛋白的傳統(tǒng)基因編碼技術(shù)的替代方案。該方案中的仿生方法既簡單又有效，填補了目前NIR-II FP局限性的重要空白，為基于熒光蛋白的生物成像開辟了機會。通過篩選大量具有不同最佳激發(fā)/發(fā)射波長的尋蛋白NIR-I/II 花青染料作為發(fā)色團(tuán)來構(gòu)建熒光蛋白，成功地實現(xiàn)了多通道成像系統(tǒng)，從而為各種生物事件的綜合監(jiān)測提供了可能性。持續(xù)開發(fā)具有更多無串?dāng)_的發(fā)射帶和更長的發(fā)射波長（例如，> 1400 nm）的花青染料將進(jìn)一步增強我們仿生熒光蛋白策略的巨大潛力。更重要的是，這種仿生蛋白質(zhì)策略還將為設(shè)計更多用于原位蛋白質(zhì)靶向目的的染料提供基本原理。

 

參考文獻(xiàn)

Xu, J., Zhu, N., Du, Y. et al. Biomimetic NIR-II fluorescent proteins created from chemogenic protein-seeking dyes for multicolor deep-tissue bioimaging. Nat Commun 15, 2845 (2024).

 

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