致病性病毒往往借助血液、唾液致和精液等體液實現(xiàn)其傳播。在有效傳播途徑中，病毒首先需要入侵人體體液環(huán)境、逃避機體的免疫防御，進而識別靶細胞上的受體、進入細胞、完成復制。在凋亡模擬病毒模型中，病毒通過將磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）暴露在病毒粒子上，劫持細胞表面的PS受體并觸發(fā)內(nèi)吞作用，從而進入細胞。馬爾堡-菲利普大學的研究人員在之前的研究中發(fā)現(xiàn)精液和唾液中的細胞外囊泡（EVs）可競爭性地阻斷寨卡病毒（Zika Virus, ZIKV）與靶細胞的結(jié)合，從而抑制其在體內(nèi)和體外的感染。

近期，該團隊在Nature Microbiology上發(fā)表了題為“Phosphatidylserine-exposing extracellular vesicles in body fluids are an innate defence against apoptotic mimicry viral pathogens”的研究論文，發(fā)現(xiàn)唾液和精液等體液中大量暴露PS的EVs可防止凋亡模擬病毒的附著從而阻斷病毒感染�？偟膩碚f，該研究揭示了一種機體直接的先天防御機制，它可以抑制病毒凋亡模仿，并可能阻斷病毒的傳播途徑。

01 ZIKV莢膜中暴露的PS對感染至關重要
作者首先對PS暴露是否對ZIKV感染至關重要這一問題進行了探究。在脫羧基酶的處理之下，PS末端的羧基被脫去，而轉(zhuǎn)變?yōu)镻E分子（圖1a）。結(jié)果顯示，PS脫羧后導致ZIKV傳染性急劇降低甚至喪失（圖1b），但沒有顯示細胞毒性。作者進一步合成了以PC為基底而含有不同PS濃度（0–100 mol%）的脂質(zhì)體，并發(fā)現(xiàn)僅含有PC的脂質(zhì)體對寨卡病毒感染沒有影響，但所有PS暴露的脂質(zhì)體都表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了ZIKV依賴于細胞凋亡模擬進行有效感染的觀點，并揭示了低比例的囊泡PS足以干擾病毒感染。

圖1.ZIKA病毒的PS對感染的重要性

02 含有PS的EVs干擾病毒粒子的細胞識別
如圖2所示，在進一步的感染機制探究中，作者發(fā)現(xiàn)在ZIKV侵染之前或者侵染過程中，含有PS的脂質(zhì)體可以有效抑制病毒的感染，但隨著病毒量的增加，這一抑制效果逐漸降低，這表明含有PS脂質(zhì)體與病毒粒子競爭細胞結(jié)合位點。而PS的各組成成分對于病毒的感染并無影響，表明囊泡形式的PS才會表現(xiàn)出抗病毒活性；且其他脂質(zhì)分子的抑制能力明顯降低。共聚焦顯微鏡成像也確認了熒光PS脂質(zhì)體以劑量依賴的方式附著在Vero E6細胞表面而減少結(jié)合的寨卡病毒粒子的數(shù)量，但PC脂質(zhì)體沒有觀察到該現(xiàn)象。因此，暴露PS的囊泡通過競爭性地干擾病毒粒子與細胞結(jié)合來抑制病毒凋亡模擬感染。

圖2.囊泡顆粒表面PS對病毒附著的干擾

03 體液來源EVs的PS暴露程度不一
為了進一步確認內(nèi)源性EVs是否也是通過PS暴露從而對病毒的凋亡模擬感染造成干擾，作者分別從五種不同的人體體液（精液、唾沫、尿液、母乳和血液）中分離得到EVs，并基于脂質(zhì)組學和液相芯片的方法鑒定發(fā)現(xiàn)這些來源的EVs均有不同程度的PS暴露，且在精液、唾液和尿液中比例較高（圖3）。

圖3. 不同體液來源的EV蛋白表達水平分析

作者進一步采用納米流式檢測技術(shù)（NanoFCM）在單顆粒水平對精液來源EVs的PS和經(jīng)典標志蛋白（TSPN: CD9/CD63/CD81）的表達情況進行分析。圖4所示，對5份不同供體來源精液EVs的PS和四次跨膜蛋白（TSPN，含CD9/CD63/CD81）進行共定位分析，TSPN陽性群體占比約為35%-45%，單PS陽性的群體占比約為8%-11%左右，而TSPN和PS雙陽比例占比約為6%-10%不等，而與PS共定位的TSPN（CD9/CD63/CD81）EVs的比例僅為18.5%左右（圖3i），即膜表面暴露PS的EVs并非均有TSPN標志蛋白的共表達�？傊�，本研究發(fā)現(xiàn)從所有測試體液中分離得到的EVs均含有暴露PS的EV亞群，在精液、唾液和尿液中含量高，在母乳和血液中含量低。

圖4. NanoFCM對五份精液來源的EVs的TSPAN（CD9/CD63/CD81）和PS（LA）共定位分析

在明確了EVs中PS的表達情況后，作者也評估和分析了體液來源EVs與病毒入侵中PS受體的相互作用和EVs表面PS存在對抑制病毒感染的能力，發(fā)現(xiàn)EVs可通過其自身暴露的PS與利用凋亡模擬的病毒形成競爭，干擾病毒感染。在拓展了病毒類型后，作者發(fā)現(xiàn)不僅僅是ZIKV，像登革熱病毒（DENV）、西尼羅河病毒（MNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、埃博拉病毒（EBOV）和皰疹性口腔炎病毒（VSV）等的感染均會受到體液中暴露PS的EVs的抑制（圖5a）。而艾滋病病毒（HIV）、丙肝病毒（HCV）、新冠病毒（SARS-CoV-2）和皰疹病毒（HSV）由于利用別的入侵受體，其感染并未受到抑制（圖5b）。總的來說，體液中EVs的具有廣譜的抗病毒活性，且對凋亡模擬病毒具有特異性。

圖5. EVs對不同類型病毒的感染抑制效果

在本論文中，研究者們發(fā)現(xiàn)了一個有趣的抗病毒防御概念——通過模仿常見的病毒入侵機制，生物物理性質(zhì)上相似的EVs可以抑制病毒的附著。具體而言，體液中的EVs通過其暴露的PS分子與病毒粒子競爭性結(jié)合細胞表面受體，從而來預防和抑制病毒感染。這類EVs在唾液和精液中的含量尤其豐富，可有效抑制口腔和性傳播病毒的感染，也為凋亡模擬病毒在人與人之間直接傳播的低發(fā)生率提供了有效的解釋和支持，同時為新型抗病毒藥物的開發(fā)提供了新的思路和理論基礎。

NanoFCM展望
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