心血管疾病(CVD)在全球范圍內(nèi)造成的死亡遠超癌癥。動脈狀硬化(AS)作為一種慢性炎癥性疾病,是多種CVD的共性病理基礎(chǔ)。靶向IL-1β的單克隆抗體藥物Canakinumab的臨床試驗(CANTOS)首次證實了AS抗炎治療以及干預(yù)NLRP3炎癥小體激活作為治療手段的可行性。血管內(nèi)皮細胞(EC)激活是AS發(fā)生的使動因素,通過介導(dǎo)白細胞的黏附和泡沫細胞的形成等參與了AS進程,但其機制尚未闡明。糖酵解(Glycolysis)過程在內(nèi)皮多種病理狀態(tài)下功能實現(xiàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但其對NLRP3炎癥小體及AS發(fā)生發(fā)展的作用和調(diào)控機制尚不清楚。
2024年4月17日,廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管平臺徐益鳴教授團隊在Cardiovascular Research(醫(yī)學(xué)1區(qū),IF=10.9)上發(fā)表了題為“Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis”的研究論文,揭示了內(nèi)皮細胞中PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解對NLRP3炎癥小體激活的全新調(diào)控通路及其在AS進程中的關(guān)鍵作用,為抗AS治療提供了全新的代謝干預(yù)靶點。該論文的通訊作者為徐益鳴教授,第一作者為廣州醫(yī)科大學(xué)博士生郭帥和復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院博士生王立濤。
研究材料
在此項目中,研究人員構(gòu)建了Apoe-/-背景的內(nèi)皮特異性PFKFB3敲除小鼠模型(Pfkfb3VEC-KO)探究內(nèi)皮PFKFB3對NLRP3炎癥小體激活及AS進程的調(diào)控作用。隨后使用AAV病毒(由賽業(yè)生物提供)實現(xiàn)了在內(nèi)皮中對CtBP1的點突變,并進行了詳細的下游機制驗證。
研究方法
在此項目中研究人員采用了多項實驗技術(shù)并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序,包括en face免疫熒光、主動脈油紅O染色、Western blotting及Real-time PCR等。在探究CtBP1與FOXP1的結(jié)合對NLRP3炎癥小體組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用時,研究人員使用了CHIP及熒光素酶報告基因?qū)嶒灐4送,研究人員還測量了胞內(nèi)NADH的水平。
技術(shù)路線
01 AS中NLRP3炎癥小體與PFKFB3的表達相關(guān)性
02 體內(nèi)外抑制PFKFB3對NLRP3炎癥小體及AS進程的影響
03 PFKFB3調(diào)控NLRP3炎癥小體的分子機制
04 CtBP1寡聚化對NLRP3炎癥小體和AS的調(diào)控作用及其機制
研究結(jié)果
1. AS斑塊中NLRP3及PFKFB3在內(nèi)皮細胞中高表達
首先,研究人員發(fā)現(xiàn)在人頸動脈AS斑塊中發(fā)現(xiàn)NLRP3和PFKFB3在內(nèi)皮細胞中高表達,并且二者存在線性關(guān)系(R2=0.4272,P=0.0212)。en face免疫熒光實驗證實,與野生型小鼠相比,Apoe-/-小鼠的主動脈內(nèi)皮中的PFKFB3和NLRP3水平明顯升高。提取主動脈內(nèi)膜RNA行Real-time PCR實驗,結(jié)果表明Apoe-/-小鼠的主動脈內(nèi)皮中的PFKFB3、NLRP3、CASP1以及IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。以上結(jié)果提示PFKFB3與NLRP3的表達量與AS的發(fā)生發(fā)展相關(guān),且二者之間存在顯著相關(guān)性。
2. 內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體和AS斑塊的形成
隨后,研究人員發(fā)現(xiàn)使用siRNA敲低PFKFB3或使用PFKFB3的特異性抑制AZ67可以顯著緩解TNFα刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)及人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)所引起的NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后,干預(yù)PFKFB3所介導(dǎo)的糖酵解也可以抑制血流狀態(tài)下內(nèi)皮與白細胞之間的相互作用。為了在體研究內(nèi)皮PFKFB3對NLRP3炎癥小體激活和AS進程的影響,研究人員構(gòu)建了內(nèi)皮特異性PFKFB3敲除鼠(Pfkfb3VEC-KO)。實驗結(jié)果表明,與對照鼠相比,Pfkfb3VEC-KO小鼠的主動脈中NLRP3的表達明顯下調(diào)。給予小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后,Pfkfb3VEC-KO小鼠顯著緩解了AS斑塊的形成。以上結(jié)果提示,體內(nèi)外干預(yù)內(nèi)皮中的PFKFB3可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活,并緩解AS斑塊的形成。此外,研究人員使用熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),干預(yù)PFKFB3調(diào)控了NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄活性。
3. 糖酵解依賴性的NADH水平介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體形成
先前的研究表明,糖酵解速率升高所產(chǎn)生的NADH可以起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用,從而架起代謝與表觀遺傳調(diào)控之間的橋梁。研究人員首先發(fā)現(xiàn),TNFA刺激顯著上調(diào)內(nèi)皮中的NADH水平和NADH/NAD+的比例。隨后,研究人員發(fā)現(xiàn)使用丙酮酸降低NADH水平可以緩解NLRP3炎癥小體形成;相反,使用乳酸鈉回補實驗上調(diào)NADH水平則可以逆轉(zhuǎn)敲低PFKFB3所產(chǎn)生的保護效應(yīng)。以上結(jié)果提示PFKFB3介導(dǎo)糖酵解的對NLRP3的調(diào)控作用依賴于胞內(nèi)NADH水平的改變。
圖3 糖酵解依賴性的NADH水平介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體形成[1]
4. NADH敏感型蛋白CtBP1的寡聚化介導(dǎo)了NLRP3激活和斑塊形成
先前的研究表明,CtBP1是NADH敏感型蛋白之一,通過響應(yīng)胞內(nèi)不斷變化的NADH水平發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。首先,結(jié)果表明TNFA促進了CtBP1的寡聚化。隨后,研究人員使用CtBP1寡聚化抑制劑MTOB及突變CtBP1的寡聚化關(guān)鍵位點(G183A)可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后研究人員構(gòu)建了內(nèi)皮細胞CtBP1(G183A)過表達AAV病毒(試驗所用AAV病毒由賽業(yè)生物提供)。給予Apoe-/-小鼠尾靜脈注射CtBP1(G183A)過表達AAV病毒可以顯著抑制NLRP3炎癥小體的形成和AS進程。
5. 單體形式的CtBP1與FOXP1結(jié)合抑制NLRP3組分基因的轉(zhuǎn)錄
CtBP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用需要與之協(xié)同的轉(zhuǎn)錄因子,研究人員通過生物信息學(xué)工具預(yù)測了CtBP1的結(jié)合蛋白及共同調(diào)節(jié)NLRP3、CASP1及IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄因子。并通過IP、CHIP及熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實單體形式的CtBP1與轉(zhuǎn)錄因子FOXP1結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制了NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄水平。
圖5 單體CtBP1與FOXP1結(jié)合抑制NLRP3組分基因的轉(zhuǎn)錄[1]
研究結(jié)論
此項研究首次證實內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解調(diào)控了NLRP3炎癥小體的形成和激活和AS斑塊形成。機制探索表明糖酵解依賴性的NADH水平升高介導(dǎo)了CtBP1的寡聚化及其與FOXP1的解離,進而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄激活。此項研究也首次闡明干預(yù)CtBP1的寡聚化可以緩解AS進程,為AS防治提供了新的干預(yù)靶點。
參考文獻:
[1]Shuai Guo, Litao Wang, Kaixiang Cao, Ziling Li, Mingchuan Song, Shuqi Huang, Zou Li, Cailing Wang, Peiling Chen, Yong Wang, Xiaoyan Dai, Xianglin Chen, Xiaodong Fu, Du Feng, Jun He, Yuqing Huo, Yiming Xu, Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis, Cardiovascular Research, 2024;, cvae071, https://doi.org/10.1093/cvr/cvae071