哈爾濱醫(yī)科大學(xué)科研人員應(yīng)用DC細(xì)胞來(lái)源的外囊泡通過(guò)加載BMP87-99A91作為誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)性免疫治療脊髓損傷疫苗的研究

脊髓損傷(SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷,由于神經(jīng)回路的破壞而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。脊髓損傷后的病理生理進(jìn)展涉及免疫反應(yīng),而CD4+T細(xì)胞是損傷后免疫反應(yīng)的重要組成部分，CD4+T細(xì)胞不同亞型之間的平衡對(duì)神經(jīng)保護(hù)至關(guān)重要。但是在脊髓損傷后的免疫應(yīng)答中，大多數(shù)CD4+ T細(xì)胞偏向于輔助性T細(xì)胞1 (Th1)和輔助性T細(xì)胞17 (Th17)。它們會(huì)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和抗體的釋放增加，會(huì)加重神經(jīng)元喪失、髓鞘形成和軸突損傷，而Treg/Th2細(xì)胞通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子在脊髓損傷后提供保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)的重要作用。改變T細(xì)胞亞群成為一種有希望的治療脊髓損傷的策略。

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)科研工作者利用DC細(xì)胞來(lái)源的外囊泡通過(guò)加載BMP87-99A91肽作為誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)性免疫治療脊髓損傷疫苗的研究。本研究根據(jù)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)衍生的細(xì)胞外小囊泡(DsEVs)可以有效地刺激T細(xì)胞活化和髓鞘堿性蛋白(MBP)的變異肽配體(APLs)可以影響CD4+ T細(xì)胞亞群并降低神經(jīng)炎癥水平特性的特點(diǎn),使用高分辨率的納米流式儀Apogee A60-Universal分別檢測(cè)：1)DC細(xì)胞和DsEVs對(duì)BMP87-99A91肽的加載效率 ;2)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)（MLR）中A91-DsEVs對(duì)共培養(yǎng)CD4+ T細(xì)胞極化的影響;3) 納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)各A91-DsEVs對(duì)小鼠脾CD4+T細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)能力。實(shí)驗(yàn)證明A91-DsEVs介導(dǎo)的微環(huán)境具有促進(jìn)軸突再生、神經(jīng)元保護(hù)、促進(jìn)髓鞘再生，從而支持脊髓損傷模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用（Fig.1）。

Fig.1

研究人員從C57BL/6小鼠(6-8周齡)股骨中分離的骨髓細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)至第6天收集細(xì)胞作進(jìn)一步分析。接著在培養(yǎng)基中加入TAT47-57-MBP87-99A91或TAT47-57-OVA抗原。24 h后更換為不含外泌體的完全培養(yǎng)基。孵育24 h后，收集上清液作進(jìn)一步分析。使用超靈敏納米流式細(xì)胞儀（Apogee A60-Universal, UK）檢測(cè)MBP87-99A91肽在DC和DsEVs上的加載效率。結(jié)果表明，MBP87-99A91肽(FITC標(biāo)記)成功加載到DC細(xì)胞(粉色)和A91-DsEVs(綠色)中，加載率分別為95.1%和67.9%(Fig.2)。

Fig.2成功從DCs培養(yǎng)基中分離出A91-DsEVs。

為了評(píng)估A91-DsEVs被DC和CD4+ T細(xì)胞內(nèi)化的情況，本研究使用1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳氰碘(Dil)標(biāo)記A91-DsEVs。然后將Dil標(biāo)記的A91-DsEVs與DC和CD4+ T細(xì)胞分別共培養(yǎng)。A91-DsEVs (橙色熒光顯示)被DC和CD4+ T細(xì)胞內(nèi)化（Fig.3a）。A91-DsEVs治療組和OVA-DsEVs治療組DCs的存活率遠(yuǎn)高于DsEVs治療組和PBS治療組。同樣，A91-DsEVs治療組和OVA-DsEVs治療組的CD4+T細(xì)胞活力高于PBS治療組(Fig.3b)。流式分析A91-DsEVs，DsEVs和PBS處理組，A91-DsEVs處理組DC中MHC II和CD80的表達(dá)更高,CD86表達(dá)明顯升高(Fig.3c)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)脾臟CD4+ T細(xì)胞的細(xì)胞亞型變化。結(jié)果顯示，A91-DsEVs治療組IFN-γ+ CD4+T和IL-17A+ CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，F(xiàn)oxp3+ CD4+T和IL-4+ CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)升高（Fig.3d）。這些發(fā)現(xiàn)表明，A91-DsEVs在體外增加DC抗原呈遞能力和調(diào)節(jié)CD4+ T細(xì)胞向Th2和Treg亞型分化的潛力。

Fig.3

為了進(jìn)一步分析A91-DsEVs對(duì)體內(nèi)脾臟CD4+T細(xì)胞極化的影響，用流式細(xì)胞術(shù)在3 dpi時(shí)從不同組小鼠中分離脾臟T細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定脾臟CD4+ T細(xì)胞的亞型。A91-DsEVs治療組顯示IL-4+CD4+和CD25+Foxp3+CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，IFN-γ+ CD4+T和IL-17A+ CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)減少(Fig.4b)。。這一結(jié)果證實(shí)了A91-DsEVs免疫脊髓損傷小鼠可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞向Th2和Treg抗炎表型的極化。

Fig.4b

為了證明A91-DsEVs刺激脾臟CD4+T細(xì)胞向損傷部位募集的能力，本研究提取了不同DsEVs組或PBS處理后的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞。這些細(xì)胞用Dil染料標(biāo)記，然后通過(guò)尾靜脈注射注入脊髓損傷小鼠。注射24 h后進(jìn)行的熒光示蹤分析顯示，與其他組相比，A91-DsEVs處理小鼠脊髓內(nèi)的Dil熒光強(qiáng)度更高(Fig.5c)。Dil熒光在脊髓和肺中的強(qiáng)度明顯高于其他器官。在7 dpi時(shí)對(duì)脊髓進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示A91-DsEVs治療組的CD4+ T細(xì)胞募集到病變區(qū)域的數(shù)量多于其他組(Fig.5d)。這些結(jié)果表明，A91-DsEVs刺激的CD4+ T細(xì)胞可能向脊髓損傷部位遷移。

Fig.5

結(jié)論：本研究表明，A91-DsEVs誘導(dǎo)抗原特異性CD4+T細(xì)胞歸巢到損傷部位，建立保護(hù)性免疫微環(huán)境，促進(jìn)脊髓損傷小鼠的功能性運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。研究結(jié)果表明，DsEV疫苗接種策略可能有助于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷或炎癥性疾病。

英國(guó)Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè) （如免疫細(xì)胞、哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

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