動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)所致心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康并且具有高致殘率和高致死率的常見慢性疾病。長期以來，高密度脂蛋白(HDL)被認(rèn)為是AS和心血管疾病的獨(dú)立保護(hù)因素，其可通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗血栓形成等多種途徑，阻抑AS的發(fā)生發(fā)展。SR-BI是HDL公認(rèn)的細(xì)胞膜受體。肝臟SR-BI可促進(jìn)HDL介導(dǎo)RCT，降低HDL-C水平，調(diào)節(jié)HDL代謝，阻抑AS進(jìn)程。肝SR-BI作為調(diào)控HDL功能及代謝的重要靶標(biāo)，如何靶向調(diào)控其表達(dá)始終是HDL代謝領(lǐng)域亟待解決的難題。

2023年10月19日，復(fù)旦大學(xué)徐延勇研究員團(tuán)隊(duì)與首都醫(yī)科大學(xué)附屬朝陽醫(yī)院李晶副教授團(tuán)隊(duì)在Developmental Cell在線發(fā)表題為“Hepatocytic lipocalin-2 controls HDL metabolism and atherosclerosis via Nedd4-1-SR-BI axis in mice”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞源分泌蛋白Lcn2通過降低Nedd4-1介導(dǎo)SR-BI K500和K508位點(diǎn)的泛素化，阻抑SR-BI降解，改善HDL代謝，促進(jìn)RCT，抑制高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的AS進(jìn)程。
 

圖片來源：《Developmental Cell》
（https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.09.007）

研究材料
C57BL/6J小鼠、Ldlr^-/-小鼠、Lcn2^fl/fl小鼠、Lcn2^-/-小鼠、Srb1^fl/fl小鼠、Srb1Hep^-/-小鼠等多個(gè)小鼠模型和攜帶Srb1（K500A K508A）突變的HepG2細(xì)胞模型（該雙點(diǎn)突變的純合HepG2細(xì)胞系由賽業(yè)生物提供）等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

研究方法
該研究使用了多種技術(shù)方法，包括：QPCR、Co-IP、Western blot、鄰位連接技術(shù)（PLA）、蛋白質(zhì)液相色譜和組學(xué)分析等技術(shù)。

技術(shù)路線
01 人類和小鼠肝臟Lcn2 mRNA的表達(dá)與血漿HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)
02 肝臟Lcn2通過SR-BI改善HDL代謝和RCT
03 Lcn2通過SR-BI維持HDL的抗炎功能，從而改善了HDL的代謝
04 Lcn2通過阻斷nedd4-1介導(dǎo)的SR-B1在K500和K508位點(diǎn)的泛素化來改善HDL的代謝

研究結(jié)果
該研究首先在臨床上發(fā)現(xiàn)人類肝臟Lcn2 mRNA的表達(dá)與血漿血漿高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平呈負(fù)相關(guān)，并在體外人原代肝細(xì)胞上和小鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，與人類數(shù)據(jù)一致，在C57BL/6J小鼠中，肝臟Lcn2 mRNA水平與血漿HDL-C水平也呈負(fù)相關(guān)。在小鼠肝細(xì)胞中過表達(dá)Lcn2增加了SR-BI蛋白的表達(dá)和肝細(xì)胞HDL的攝取。
 

圖1 Lcn2通過上調(diào)SR-BI的表達(dá)來增強(qiáng)肝細(xì)胞對HDL的攝取^[1]

為了進(jìn)一步探究Lcn2通過上調(diào)SR-BI的表達(dá)來增強(qiáng)肝細(xì)胞對HDL的攝取的具體機(jī)制，研究人員檢查了mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)Nedd4-1在K500和K508處泛素化SR-BI，并可被Lcn2阻斷，Lcn2在體內(nèi)和體外都能調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中的SR-BI泛素化。
 

圖2 肝細(xì)胞Lcn2通過Nedd4-1調(diào)控SR-BI泛素化^[1]

為了研究Nedd4-1調(diào)控SR-BI泛素化的潛在機(jī)制，研究人員在SR-BI的C端可能檢測了NEDD4介導(dǎo)的泛素化位點(diǎn)。經(jīng)過篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)只有兩個(gè)候選泛素化位點(diǎn)（K500A和K508A）的同時(shí)突變才能消除人類的誘導(dǎo)SR-BI被Nedd4-1泛素化。
 

圖3 Lcn2結(jié)合SR-BI的C端，阻斷nedd4-1介導(dǎo)的K500和K508泛素化^[1]

為了研究Nedd4-1介導(dǎo)的SR-B1泛素化是否是Lcn2調(diào)控SR-BI蛋白穩(wěn)定性和HDL代謝所必需的，研究人員生成了SR-BI（K500A/ K508A）位點(diǎn)突變的(Srb1^MutI/Mut)HepG2細(xì)胞（該雙點(diǎn)突變的純合HepG2細(xì)胞系由賽業(yè)生物提供）和(Srb1^MutI/Mut)小鼠，研究發(fā)現(xiàn)在突變細(xì)胞和突變小鼠中Lcn2對HDL代謝的改善效果被消除。
 

圖4 肝細(xì)胞Lcn2通過調(diào)節(jié)nedd4-1介導(dǎo)的SR-B1在K500和K508處的泛素化來改善HDL的代謝^[1]