腫瘤免疫學作為近年來備受矚目的研究領域，正以其迅猛的發(fā)展態(tài)勢引領著細胞療法的繁榮。自2017年諾華的Kymriah獲美國FDA批準上市以來，全球共有11款CAR-T細胞療法產(chǎn)品獲批上市，其中5款為國內(nèi)上市。

據(jù)沙利文分析，2021~2025年全球CAR-T市場預計將以47%的CAGR增長到80.3億美元，并將以21%的CAGR增長到2030年的211.4億美元，而中國2030年的CAR-T市場規(guī)模則有望達到289億元。這得益于上市CAR-T療法在血液瘤治療中取得的顯著成效，CD19、BCMA兩大熱門靶點實現(xiàn)了精準打擊。然而，當我們將視線轉向實體瘤時，情況就變得復雜起來。


◀︎來源：沙利文
 
實體瘤往往是個堅實的團狀物，豐富的腫瘤相關成纖維細胞（CAF）和血管還會包裹它，形成了天然厚實的物理屏障，CAR-T細胞往往難以浸潤。同時，實體瘤會抑制某些趨化因子的分泌，影響T細胞向腫瘤微環(huán)境的遷移。面對腫瘤微環(huán)境（TME）的低pH、低氧、高滲透特性，CAR-T細胞的存活能力與殺傷力被極大的削弱。

并且，實體瘤中的腫瘤特異性抗原（TSA）很少，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤高表達靶點多為腫瘤相關抗原（TAA），在正常組織中也有少量表達，且具有高度異質(zhì)性，導致安全有效的實體瘤靶點十分稀缺。
面對占比90%以上的實體瘤，CAR-T療法存在巨大的臨床需求。隨著CAR-T研發(fā)的持續(xù)深入，針對實體瘤的解決方案也逐漸豐富，比如多樣化的靶點選擇、武裝化的CAR-T改造、新穎的邏輯門控設計，既是細胞治療行業(yè)競爭的重要突破口，也是克服實體瘤挑戰(zhàn)的關鍵“密鑰”。
    
 
探尋實體瘤靶點，誰將兼具有效性與安全性

合適的實體瘤靶點能夠有效提高CAR-T細胞特異性，避免殺傷機體的健康組織。近年來，Claudin18.2的靶向藥物在胃癌等惡性實體瘤的治療中展現(xiàn)出了卓越療效，不僅安全可靠，且患者耐受性良好，已被視為胃癌、胰腺癌等實體腫瘤免疫治療領域的新星。
 

◀︎來源：實體瘤免疫細胞療法的全球競爭格局分析報告，數(shù)據(jù)統(tǒng)計截止2024.3.1

2024年2月，國際知名期刊《Front Immunol》刊登了一則關于靶向Claudin18.2的CAR-T細胞療法治療晚期胰腺癌患者，并達到完全緩解的病例報告，引起行業(yè)的廣泛關注。
 
在Claudin18.2這樣的經(jīng)典實體瘤靶點之外，對新靶點的探索也從未停止。2023年10月末，Chimeric Therapeutics宣布，美國FDA已經(jīng)批準其全球首款CDH17靶向的CAR-T細胞療法CHM 2101的IND申請，預計將在2024年開展一項針對晚期結腸直腸癌、胃癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的多中心1期臨床試驗。
 
這些進展將激發(fā)研發(fā)人員對CAR-T的進一步研究，以開發(fā)靶向一些類似的先前未被重視的TAA。
 
 
CAR-T“武裝化”，應對腫瘤微環(huán)境

工程化修飾CAR-T細胞促使其分泌刺激因子或PD-1是一個具有前景的研究方向。
去年年初，強生旗下Janssen Biotech與Simcha達成一項合作，強生將把Simcha的抗誘餌白細胞介素-18（DL-18）技術融入選定的CAR-T細胞療法候選產(chǎn)品中。IL-18在CAR-T細胞中表達能夠增強CAR-T細胞增殖和抗腫瘤活性，同時還可減少CAR-T細胞的使用量及全身給藥的副作用。IL-18還可能對各種類型的腫瘤具有廣泛的活性，包括免疫原性強的“熱”腫瘤和對免疫治療有抵抗性的“冷”腫瘤。
今年《NEJM》上發(fā)表的一篇研究論文也展現(xiàn)了一種創(chuàng)新的聯(lián)用武裝策略，研究者將CAR-T細胞療法和雙特異性抗體這兩種獨立的癌癥治療策略結合起來，讓靶向EGFRvIII的CAR-T細胞表達并分泌靶向野生型EGFR的T細胞接合抗體分子（TEAM）。在該產(chǎn)品的1期臨床試驗中，3名患有復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤的患者在接受CARv3-TEAM-E T細胞療法治療后，腫瘤在幾天內(nèi)就出現(xiàn)了顯著消退，其中1名患者的腫瘤近乎完全消失。
 

◀︎來源：《NEJM》
 

邏輯門控：雙保險提升安全性

面對大多數(shù)實體腫瘤靶抗原與正常細胞共享所產(chǎn)生的毒副作用，研究人員試圖應用布爾邏輯門控（Boolean Logic Gate, 包含AND,OR,NOT）方法對CAR-T細胞進行脫靶毒性預防。
 

◀︎邏輯門CAR-T細胞的原理 （圖片來源：參考資料[4] ）

在來自于斯坦福大學在《NATURE》上發(fā)表的“CAR-T cell design: approaching the elusive AND-gate”一文中，作者設計了一種基于AND的邏輯門控細胞內(nèi)網(wǎng)絡（LINK CAR），使之可以保護只表達一種目標抗原的正常組織，擴大CAR-T細胞靶向的分子范圍，在實體瘤的治療中能夠提高特異性和安全性。
 
 
多重精準檢測
助力實體瘤CAR-T行穩(wěn)致遠

這些新的技術探索極有可能為腫瘤治療領域帶來了革命性的變革，為患者提供新的希望與可能性。然而，這些創(chuàng)新性的治療策略發(fā)展也對臨床前研發(fā)階段中的多個關鍵指標，尤其是細胞表型檢測、殺傷功能的即時性與持久性，以及脫靶毒性等方面，提出了新的挑戰(zhàn)和迫切的需求。

一  細胞表型的精準檢測提高治療效果

在針對實體瘤CAR-T細胞療法的研究中，對新興細胞表型地不斷探索，不僅可以揭示細胞的生物學特性，還有助于開發(fā)新型的細胞治療策略。通過掌握細胞表型的規(guī)律，甚至可能干預細胞與宿主環(huán)境的相互作用，從而提高細胞治療的效果。

T細胞的體外擴增是CAR-T等過繼細胞療法生產(chǎn)工藝的關鍵步驟。在賽多利斯發(fā)布的“An Optimized, Multiplexed Assay for Screening Ex Vivo Conditions which Increase Memory T Cell Frequency” 一文中，研究表明：在體外T細胞擴增過程中，讓T細胞產(chǎn)物中產(chǎn)生更高比例的Tscm和Tcm對于細胞治療的顯著臨床改善至關重要。而傳統(tǒng)的檢測方法需要在不同平臺上運行多個分析過程才能確認不同種類細胞的各項關鍵參數(shù)，不僅效率低下，還會大量消耗寶貴的樣品。

因此研究人員在T細胞表型和功能分析監(jiān)測中應用了賽多利斯的iQue® 高通量流式細胞儀，該設備具有較寬的固定動態(tài)范圍，可在不同階段對記憶型T細胞表型和功能進行空間和時間的分析，避免不同時間點的差異，從而增強數(shù)據(jù)完整性。

此外，iQue® 可以實現(xiàn)高通量、多功能的細胞因子分析。在文章中，研究人員同時進行IFN和IL-10分泌情況的定量分析和表型分析來評估細胞功能，并且使用了來自三個供體的人外周血單核細胞(PBMC)，在14 種不同的培養(yǎng)條件下進行篩選研究。這種一站式的分析方法不僅提高了篩選研究效率，還能提供更為全面和深入的生物學洞察。
 

▲iQue® 分析結果顯示記憶型T細胞頻比例變化（圖片來源：參考資料^[5]）
 

二  高效、精準的殺傷力，是各類創(chuàng)新策略的殊途同歸

腫瘤微環(huán)境嚴重削弱了CAR-T的殺傷力，而殺傷力直接決定了其治療癌癥的效果�？梢哉f，CAR-T細胞高效、精準地殺傷腫瘤細胞是各類創(chuàng)新策略的殊途同歸。為此，研究者在探尋更安全的實體瘤靶點與邏輯門開關等策略。然而創(chuàng)新策略能否真正奏效，還需檢測來驗證。

美國費城兒童醫(yī)院的研究人員以神經(jīng)母細胞瘤作為研究對象，篩選出了特異存在于腫瘤細胞表面的多肽，以這些多肽為靶點的CAR-T稱為PC-CAR，并選擇一種源自PHOX2B的未突變的神經(jīng)母細胞瘤肽為靶點，使用Octet® 分子互作分析系統(tǒng)測得其與PHOX2B親和力為13nM。

隨后，研究人員運用Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)來檢測免疫細胞的殺傷活力。在殺傷實驗中，加入Caspase 3/7 紅色熒光染料后，Incucyte® 可對細胞進行實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測分析，并通過高分辨率紅色熒光面積和綠色熒光面積直觀得出信息。紅色熒光面積升高快，綠色熒光（靶點細胞即腫瘤細胞）下降快，則代表殺傷效果越大，非常直觀。

同時，集成式軟件可以簡化數(shù)據(jù)分析，快速獲得結果，并生成可供發(fā)表的圖表和繪圖。從下圖可以看出，Incucyte® 的分析數(shù)據(jù)顯示，PC-CAR對SKNAS膠質(zhì)瘤細胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，有望成為攻克實體瘤的有效靶點。
 

▲ Incucyte® 實時活細胞成像（圖片來源：參考資料^[6]）
a左圖為PC-CAR對SKNAS膠質(zhì)瘤細胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，a右圖為PC-CAR對其他腫瘤細胞（不呈遞PHOX2B）的殺傷則不明顯；b圖從靶細胞動態(tài)增殖水平來觀察，發(fā)現(xiàn)PC-CAR對SKNAS等膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用明顯。
 
 
三  控制脫靶毒性：安全性的重要防線

控制脫靶毒性是細胞療法研發(fā)中對安全性的重要考驗，尤其是面對靶點多為腫瘤相關抗原（TAA）的實體瘤。CAR-T在攻擊實體瘤時，存在攻擊到正常細胞的風險，導致脫靶毒性，不僅降低治療效果，還會帶來嚴重的副作用。因此，在臨床前研發(fā)階段，研究人員需要深入探索脫靶毒性的發(fā)生機制，并開發(fā)有效的預防和減輕脫靶毒性的策略。在驗證邏輯門CAR-T的殺傷力與脫靶效應時，也有研究者運用了Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)作為“檢測神器”。

2022年4月27號，斯坦福大學醫(yī)學院的Crystal L. Mackall教授課題組在《Cell》雜志上報道了一種名為SNIP的高性能藥物可調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可利用FDA批準的一款小分子來調(diào)節(jié)CAR-T活性。研究人員使用Incucyte® 快速準確地評估了不同版本的SNIP CAR-T針對靶細胞的殺傷活性，以及藥物對SNIP CAR-T細胞的調(diào)控活性。
 

▲ SNIP工作機理（圖片來源：參考資料^[7]）

如下圖所示，Incucyte® 的分析結果顯示，SNIP CAR-T細胞平臺提供了可靠的安全開關，降低了CAR-T細胞的脫靶毒性，SNIP系統(tǒng)在Off狀態(tài)下沒有明顯的“泄露”活性，一旦被激活則具有更強和更快的腫瘤殺傷動力學。在ON狀態(tài)下具有腫瘤殺傷活性且強于組成型的CAR-T細胞，同時其在多種原位實體瘤模型中的療效均優(yōu)于組成型CAR-T細胞平臺。
 

▲Incucyte® 分析數(shù)據(jù)（圖片來源：參考資料^[7]）
 

四  萬事具備，只待快速放行


除了脫靶效應外，CAR-T細胞治療的安全性與快速準確的微生物質(zhì)量控制檢測也密不可分。微生物污染可能會導致接受者危及生命的感染，因此無菌檢查是任何細胞治療產(chǎn)品的放行檢測中的關鍵組成部分�？焖�、準確、高效的檢測方法能為細胞藥物的安全性提供有力保障。

目前的藥典推薦的無菌檢查方案需要14天才能確定排除污染，這對于有效期短的細胞療法藥品太久，更何談那些用于治療晚期病人的自體細胞療法藥品。因此，市場對不依賴于微生物生長的快速檢測方法的需求與日俱增。

有研究者使用人外周血單核細胞（HPBMC）、Jurkat 細胞和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞作為代表性背景模型，評估了Microsart® ATMP 提取試劑盒和Microsart®  ATMP 細菌/真菌/支原體測定快速檢測試劑盒在高密度細胞培養(yǎng)物中的檢測能力。

結果表明，即使在高細胞背景下，賽多利斯Microsart® ATMP無菌放行試劑盒也可以快速檢測微生物污染，在3小時內(nèi)提供QC結果，這相比基于培養(yǎng)法的QC放行節(jié)約了90%以上的時間，不僅有助于降低細胞治療產(chǎn)品的風險，保證患者的安全，還能加快治療藥物的臨床可及速度。
 
 

細胞療法的卓越應用，其核心在于對細胞生產(chǎn)制備與檢測環(huán)節(jié)的精細控制和高質(zhì)量保障。面對挑戰(zhàn)重重的實體瘤治療，目前急需采用高效、可靠的檢測手段來優(yōu)化升級CAR-T設計，以提供精確無誤的細胞質(zhì)量和數(shù)量信息。這不僅有助于細胞治療產(chǎn)品在臨床前的全面評估，還能確保生產(chǎn)后的標準化檢測得以準確進行。

賽多利斯憑借一系列先進的技術和產(chǎn)品，為CAR-T療法的研發(fā)提供了堅實的后盾，顯著提升了研發(fā)效率，并極大地增強了患者治療的有效性與安全性。展望未來，隨著科技的持續(xù)進步，我們期待更多借助先進技術支持的CAR-T療法能夠成功上市，為實體瘤等疾病的治療帶來劃時代的突破，造福廣大患者。