本文要點(diǎn)：將分子成像擴(kuò)展到短波紅外（SWIR，900-1400 nm）區(qū)域，可以對(duì)生命系統(tǒng)中的生物分子進(jìn)行深層組織可視化。目前只有吲哚菁綠（ICG）及其類似物被批準(zhǔn)用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，但小于 800 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)限制了這些探針的深層組織穿透和非侵入性熒光成像。在此，介紹了基于ICG的π共軛延伸花青染料，合成ICG-C9和ICG-C11作為生物相容性，以及發(fā)射波長(zhǎng)分別為922和1010 nm的水溶性SWIR發(fā)射探針。此外，還合成了基于 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的熒光標(biāo)記劑，用于開發(fā) SWIR 分子成像探針。使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11，通過可視化活小鼠的表面受體（EGFR 和HER2）和腫瘤脈管系統(tǒng)來(lái)演示乳腺腫瘤的三色 SWIR 熒光成像。此外，本研究展示了使用 ICG 偶聯(lián)的抗癌藥物 Kadcyla 和 ICG-C9 或 ICG-C11 偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白 V 對(duì)乳腺腫瘤凋亡進(jìn)行雙色 SWIR 熒光成像。最后，我們展示了Kadcyla誘導(dǎo)的乳腺腫瘤縮小的長(zhǎng)期（38天）SWIR熒光成像。本研究為使用生物相容性和水溶性SWIR發(fā)射探針進(jìn)行多重?zé)晒夥肿映上裉峁┝艘话悴呗浴?/span>

 

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然而，當(dāng)ICG用作SWIR熒光團(tuán)時(shí)，其激發(fā)波長(zhǎng)被限制在800nm以下。對(duì)于多路復(fù)用SWIR熒光成像，需要具有更長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的ICG類似物。增加花青染料聚亞甲基鏈中一個(gè)雙鍵的長(zhǎng)度有助于將其吸收和發(fā)射最大染料轉(zhuǎn)移到大約 100 nm 的波長(zhǎng)。因此，我們合成了π共軛擴(kuò)展的ICG類似物ICG-C9和ICG-C11，它們?cè)谒�相中的發(fā)射波長(zhǎng)分別以922和1010nm。此外，基于 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 合成了SWIR 熒光標(biāo)記劑，用于 SWIR 區(qū)域的多色熒光分子成像。盡管在合成SWIR熒光探針方面付出了巨大努力，但適用于生物醫(yī)學(xué)研究的多路SWIR熒光分子成像技術(shù)尚未完全建立。本研究旨在提出一種可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的多路復(fù)用SWIR分子成像的通用策略。使用與 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗體偶聯(lián)物，我們通過可視化表面受體（表皮生長(zhǎng)因子受體 （EGFR））來(lái)演示乳腺腫瘤的多重 SWIR 熒光分子成像和人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 （HER2）和活小鼠的腫瘤脈管系統(tǒng)。此外，本文演示了使用 ICG 偶聯(lián)的 Kadcyla（曲妥珠單抗 emtansine）對(duì)腫瘤凋亡進(jìn)行多路 SWIR 熒光成像和 ICG-C9（或 ICG-C11）偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白 V。最后，我們展示了使用 ICG-C9 偶聯(lián)的 Kadcyla 的 SWIR 熒光對(duì)乳腺腫瘤縮小進(jìn)行長(zhǎng)期（38 天）成像。通過展示SWIR熒光分子成像，我們的研究結(jié)果表明，ICG和基于ICG的π共軛延伸的花青染料應(yīng)該是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)SWIR熒光團(tuán)。

圖1. ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的光學(xué)特性

 

本文合成了兩種π共軛延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11，作為ICG類似物用于多路復(fù)用SWIR熒光成像。ICG-C9 和ICG-C11 的π偶聯(lián)長(zhǎng)度比 ICG 中的雙鍵長(zhǎng) 1 倍和 2 倍。由于花青染料的最大熒光隨著聚亞甲基鏈中一個(gè)雙鍵的增加而增加約 100 nm，ICG-C9 和ICG-C11 可以發(fā)射的波長(zhǎng)分別比 ICG 長(zhǎng)約 100 或 200 nm。

二甲基亞砜 （DMSO） 中 ICG 的最大熒光為830 nm，而 DMSO 中 ICG-C9 和 ICG-C11 的熒光最大值分別為 955 nm 和 1078 nm（圖 1b）。與DMSO中的熒光光譜相比，ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中的熒光光譜顯示出25-68 nm的藍(lán)移（圖1c）。在水相中，ICG、ICG-C9 和 ICG-C11的吸收光譜（圖 1b、c）顯示肩峰的吸光度增加（DMSO 中 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的吸光度分別為 730、805 和 902 nm）。這一發(fā)現(xiàn)表明，聚集的花青染料種類的量在ICG

盡管ICG、ICG-C9和ICG-C11在純水中的熒光發(fā)射非常微弱，但在BSA存在下它們的熒光發(fā)射明顯改善。因此，我們使用含有 BSA 的 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 水溶液進(jìn)行 SWIR 熒光成像。使用三個(gè)帶通濾光片（900 ± 25、1000 ± 25 和1100 ± 25 nm）在 785、905 和 975 nm 的不同波長(zhǎng)下激發(fā)，檢查 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在水相 （1% BSA） 中的熒光亮度（圖 1d）。當(dāng)ICG、ICG-C9和ICG-C11的水溶液（1%BSA）在785 nm處被激發(fā)時(shí)，僅觀察到ICG在900 nm處的SWIR熒光發(fā)射。在 905 nm 激發(fā)時(shí)，ICG-C9 和ICG-C11 在 1000 nm 處觀察到 SWIR 熒光發(fā)射。相反，當(dāng)溶液在975 nm處激發(fā)時(shí)，ICG-C11發(fā)射了1100 nm處的SWIR熒光發(fā)射。這些結(jié)果表明，使用ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm/Em：1000 nm）或ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C11（Ex：975 nm/Em：1100 nm）的組合，可以實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用SWIR熒光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 DMSO 中的熒光量子產(chǎn)率分別為 13%、4.3% 和 2.1%。而ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中（1%BSA）的含量分別為3.4%、1.2%和0.12%（圖1e）。
接下來(lái)，本文研究了 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 在水（1% BSA）中的水穩(wěn)定性。盡管菁染料ICG、ICG-C9和ICG-C11在水溶液中不穩(wěn)定。但由于與BSA絡(luò)合，BSA的存在顯著提高了它們的化學(xué)穩(wěn)定性（圖1f）。檢測(cè)了 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在785、905 和 975 nm 激光器 （20 mW/cm） 下的光穩(wěn)定性（圖 1g）。我們觀察到，用激光照射 60 分鐘導(dǎo)致 ICG （30%）、ICG-C9 （25%） 和 ICG-C11 （20%） 發(fā)生光漂白。

通過測(cè)量三種花青染料的時(shí)間分辨熒光衰減曲線，檢查了它們的熒光壽命。PBS（1% BSA）中ICG、ICG-C9和ICG-C11的所有熒光衰減曲線均可擬合到一條指數(shù)曲線上，ICG、ICG-C9和ICG-C11的熒光壽命分別為0.80、2.7和7.1 ns（圖1h）。

圖2. 合成 SWIR 熒光標(biāo)記劑、N-羥基琥珀酰亞胺酯 （NHS）、馬來(lái)酰亞胺和 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的炔烴衍生物

 

作為SWIR熒光標(biāo)記劑，我們合成了ICG、ICG-C9和ICG-C11的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）、馬來(lái)酰亞胺和炔烴衍生物（圖2a，支持信息，方案S4-S10）。(6,43)與ICG、ICG-C9和ICG-C11偶聯(lián)抗體的制備方法如圖2b所示。合成SWIR熒光標(biāo)記劑的詳細(xì)方案和程序在支持信息中進(jìn)行了描述。雖然熒光標(biāo)記劑ICG-NHS，(43)ICG-馬來(lái)酰亞胺和ICG-炔烴是市售的，其表征尚未報(bào)道。在這里，我們描述了ICG-馬來(lái)酰亞胺和ICG-炔烴的合成和表征（支持信息，方案S4和S5）以及ICG-C9和ICG-C11的馬來(lái)酰亞胺和炔烴衍生物。熒光標(biāo)記劑ICG-C9-NHS是通過化合物6和NHS之間的酯化反應(yīng)獲得的（支持信息，方案S6）�；�合物6與1-（2-氨基乙基）馬來(lái)酰亞胺鹽酸鹽與丙炔胺的縮合反應(yīng)分別得到ICG-C9-馬來(lái)酰亞胺和ICG-C9-炔烴（支持信息，方案S7和方案S8）。類似的縮合反應(yīng)用于合成ICG-C11-馬來(lái)酰亞胺和ICG-C11-炔烴。

 

本文使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的 NHS、馬來(lái)酰亞胺和炔烴衍生物對(duì)抗體分子進(jìn)行 SWIR 熒光標(biāo)記（圖 2b）。NHS衍生物用于標(biāo)記整個(gè)抗體分子中的氨基。馬來(lái)酰亞胺衍生物用于標(biāo)記還原抗體分子中的巰基。最后，利用炔烴衍生物基于點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記抗體分子，其中疊氮化物基團(tuán)被引入抗體分子中（圖2b）。SWIR染料抗體（赫賽�。┡悸�(lián)物的吸收和熒光光譜如圖2c所示。ICG-Ab、ICG-C9-Ab和 ICG-C11-Ab（Ab：赫賽汀）分別在 820、921 和 1039 nm 處觀察到最大熒光。根據(jù)SWIR花青染料的消光系數(shù)，ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab的抗體/SWIR染料標(biāo)記率分別為0.5、0.8和1.1。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在水中的最大摩爾消光系數(shù)為14.7×104， 9.55 × 104和 5.48 × 104M–1cm–1。與 ICG-Ab 和 ICG-C9-Ab 相比，ICG-C11-Ab 的標(biāo)記率更高可能是由于 ICG-C11 的疏水性更高，導(dǎo)致 SWIR 染料對(duì)抗體分子的可及性增加。

 

本文對(duì)活體小鼠的乳腺腫瘤進(jìn)行了SWIR熒光成像。通過將EGFR陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-468）移植到裸鼠中來(lái)制備攜帶乳腺腫瘤的小鼠。將ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux和ICG-C11-NHS-Erbitux靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并在所有注射ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux或ICG-C11-NHS-Erbitux的乳腺腫瘤中檢測(cè)到腫瘤的SWIR熒光發(fā)射（>1000nm）（圖3b中第4天的左圖）。在SWIR熒光成像中，ICG、ICG-C9和ICG-C11分別在785、905和975 nm處被激發(fā)。由于組織自發(fā)熒光較低，具有較長(zhǎng)波長(zhǎng)（ICG-C9 為 905 nm，ICG-C11 為975 nm）的激發(fā)具有較低的背景信號(hào)優(yōu)勢(shì)。乳腺腫瘤的離體圖像清楚地表明，SWIR染料-Erbitux偶聯(lián)物在乳腺腫瘤中顯著積累（圖3b中的右圖）。

此外，使用由 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的馬來(lái)酰亞胺和炔烴衍生物制備的 SWIR 染料-Erbitux偶聯(lián)物對(duì)攜帶乳腺腫瘤的小鼠進(jìn)行了 SWIR 熒光成像。與注射SWIR染料-NHS-Erbitux偶聯(lián)物的小鼠一樣，在注射SWIR染料-（馬來(lái)酰亞胺或炔烴）-偶聯(lián)的Erbitux的小鼠中觀察到來(lái)自乳腺腫瘤的顯著SWIR熒光發(fā)射（圖3c，d）。這些結(jié)果還支持 SWIR 染料-（馬來(lái)酰亞胺或炔烴）偶聯(lián)的 Erbitux 在 EGFR 陽(yáng)性乳腺腫瘤 （MDA-MB-468） 中的積累。

圖4. 乳腺腫瘤的多重SWIR熒光分子成像

 

為了實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用SWIR熒光成像，選擇ICG（Ex：785 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm）或ICG（Ex：785 nm）和ICG-C11（Ex：905或975 nm）的組合來(lái)進(jìn)行雙色SWIR熒光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 785、905 和 975 nm 處激發(fā)時(shí)的熒光強(qiáng)度總結(jié)在圖 4d 中。

 

對(duì)于兩種表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2的SWIR熒光分子成像，我們制備了兩種類型的乳腺荷瘤小鼠（KPL-4和MDA-MB-468）。在KPL-4細(xì)胞移植小鼠中，使用ICG-PD-L1（紅色，Em：1000nm）和ICG-C11-赫賽�。ňG色，Em > 1050nm）的雙色SWIR熒光發(fā)射對(duì)乳腺腫瘤進(jìn)行清晰成像（圖4g）。移植MDA-MB-468細(xì)胞的腫瘤小鼠（PD-L1陽(yáng)性和EGFR陽(yáng)性，圖4e）的雙色SWIR成像也成功。使用ICG-PD-L1（紅色，Em：1000nm）和ICG-C11-Erbitux（綠色，Em：1100nm）進(jìn)行成像（圖4小時(shí)）。

此外，我們進(jìn)行了三色SWIR熒光成像，以可視化KPL-4移植小鼠的兩種表面受體（HER2和EGFR）和腫瘤脈管系統(tǒng)（圖4i）。使用三種類型的SWIR熒光探針（ICG-赫賽汀，ICG-C11-Erbitux和ICG-C9）進(jìn)行成像。ICG-赫賽汀注射后 1 天進(jìn)行 HER2 的 SWIR 熒光成像。在 KPL-4 細(xì)胞移植腫瘤中觀察到強(qiáng)烈的 SWIR 熒光發(fā)射（Em：900 nm，Ex：785 nm）（圖 4i 中第 2 天的紅色圖像）。注射 ICG-C11-Erbitux 后，在腫瘤中還觀察到 ICG-C11-Erbitux 的 SWIR 熒光發(fā)射（例如：905 nm，Em > 1050 nm）（圖 4i 中第 3 天和第 4 天的綠色圖像）。紅色和綠色通道的合并圖像清楚地顯示了 HER2 和 EGFR 在 KPL-4細(xì)胞移植乳腺腫瘤中的共定位。最后，我們進(jìn)行了腫瘤新生血管系統(tǒng)的成像(50)通過將ICG-C9（含有1%BSA的PBS中的0.1mM）注射到腫瘤小鼠中（圖4中第4天的青色彩色圖像i）。ICG-C9 用 905 nm 激光激發(fā)，并使用 1000 nm 帶路徑濾光片檢測(cè)其熒光發(fā)射。盡管用 905 nm 光照射會(huì)激發(fā) ICG-C9 和 ICG-C11-Erbitux，但 SWIR 熒光主要在 ICG-C9 中觀察到。這是因?yàn)樽⑸涞叫∈篌w內(nèi)的ICG-C9（200μL0.1mM PBS溶液）的量遠(yuǎn)大于ICG-C11-Erbitux（100μL1μM PBS溶液）的量。HER2和血管的合并圖像顯示，KPL-4移植小鼠的腫瘤脈管系統(tǒng)是在乳腺腫瘤周圍發(fā)育的。

圖5. 腫瘤凋亡的SWIR熒光成像

 

對(duì)于腫瘤凋亡的體內(nèi)成像，我們制備了細(xì)胞凋亡檢測(cè)探針，即SWIR染料偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V，使用ICG-NHS、ICG-C9-NHS 和ICG-C11-NHS（圖 5a）。SWIR染料偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V（ICG-Annexin V、ICG-C9-Annexin V和ICG-C11-Annexin V）的吸收光譜證實(shí)了ICG、ICG-C9和ICG-C11與膜聯(lián)蛋白V分子的偶聯(lián)（圖5b）。

將 KPL-4 細(xì)胞與和不與 Kadcyla 一起孵育 3 天。在與 Kadcyla 一起孵育的 KPL-4 細(xì)胞中檢測(cè)到 ICG 偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白 V 的熒光信號(hào)，但在對(duì)照細(xì)胞（與無(wú) Kadcyla 一起孵育）中未檢測(cè)到。這些結(jié)果表明，ICG-Annexin V可用作活細(xì)胞中的凋亡檢測(cè)探針。

在靜脈注射Kadcyla的KPL-4細(xì)胞移植腫瘤小鼠中進(jìn)行腫瘤凋亡的SWIR熒光成像。注射Kadcyla后1天，將ICG-Annexin V注射到小鼠體內(nèi)，通過檢測(cè)腫瘤中ICG-Annexin V的SWIR熒光（>1000 nm）進(jìn)行SWIR熒光成像。與對(duì)照小鼠（Kadcyla−）相比，注射Kadcyla的小鼠（Kadcyla+）表現(xiàn)出來(lái)自乳腺腫瘤的強(qiáng)烈SWIR熒光發(fā)射，表明Kadcyla誘導(dǎo)腫瘤凋亡（圖5d）。對(duì)兩只小鼠（Kadcyla +和Kadcyla−）的腫瘤離體圖像的比較清楚地表明，在注射Kadcyla的小鼠中誘導(dǎo)了腫瘤凋亡（圖5d中的右圖）。

為了確認(rèn) Kadcyla 誘導(dǎo)腫瘤凋亡，我們使用 ICG 偶聯(lián)的 Kadcyla （ICG-Kadcyla） 和 ICG-C9-Annexin V 或 ICG-C11-Annexin V 進(jìn)行雙色 SWIR 熒光分子成像。ICG-Kadcyla（紅色）和ICG-C9-（或ICG-C11-）膜聯(lián)蛋白V（綠色）的合并圖像顯示了Kadcyla和膜聯(lián)蛋白V在乳腺腫瘤中的共定位（圖5e，f中上圖的右圖）。這表明 Kadcyla 誘導(dǎo)的 KPL-4 移植裸鼠的腫瘤凋亡。相比之下，對(duì)照小鼠（注射無(wú)Kadcyla）沒有顯示來(lái)自腫瘤的ICG-C9-Annexin V或ICG-C11-Annexin V的SWIR熒光發(fā)射（圖5e，f中的下圖圖像）。

圖6. ICG-C9-Kadcyla誘導(dǎo)的乳腺腫瘤縮小的長(zhǎng)期SWIR熒光成像

 

最后，本文研究了花青染料的SWIR熒光是否可用于體內(nèi)腫瘤凋亡的長(zhǎng)期成像。為了監(jiān)測(cè)抗腫瘤藥物Kadcyla誘導(dǎo)的腫瘤凋亡，我們通過用ICG-C9-NHS標(biāo)記Kadcyla來(lái)制備ICG-C9偶聯(lián)的Kadcyla（ICG-C9-Kadcyla）。在注射ICG-C9-Kadcyla的乳腺腫瘤（KPL-4）小鼠中進(jìn)行長(zhǎng)期SWIR熒光成像。在ICG-C9-Kadcyla注射后2-38天采集SWIR熒光圖像（圖6a）。注射Kadcyla后約1個(gè)月，乳腺腫瘤的大小減小了12倍（圖6b，c），表明Kadcyla誘導(dǎo)的腫瘤縮小顯著。此前，我們報(bào)道了使用 ICG-赫賽汀和 ICG-C11-膜聯(lián)蛋白 V 分別對(duì)腫瘤凋亡進(jìn)行 9 天和 15天的長(zhǎng)期成像。目前使用ICG-C9-Kadcyla的結(jié)果，加上早期報(bào)道的結(jié)果，表明ICG-C9的SWIR熒光發(fā)射以及ICG和ICG-C11的SWIR熒光發(fā)射適用于活小鼠腫瘤凋亡的長(zhǎng)期成像。

 

結(jié)論

本文開發(fā)了π共軛延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11。SWIR成像技術(shù)的重要特點(diǎn)是使用在SWIR區(qū)域發(fā)射的生物相容性和水溶性花青染料ICG-9和ICG-C11。ICG-9 和 ICG-C11 可以在大約 900 和1000 nm 處激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)多色 SWIR 熒光成像。使用ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗體偶聯(lián)物，我們展示了 HER2 陽(yáng)性和 EGFR 陽(yáng)性荷瘤小鼠表面受體和腫瘤脈管系統(tǒng)的多路 SWIR 熒光成像。此外，還展示了抗癌藥物Kadcyla誘導(dǎo)的乳腺腫瘤縮小的長(zhǎng)期（38天）SWIR熒光成像。

 

參考文獻(xiàn)

Swamy M M M, Murai Y, Monde K, et al. Biocompatible and Water-Soluble Shortwave-Infrared (SWIR)-Emitting Cyanine-Based Fluorescent Probes for In Vivo Multiplexed Molecular Imaging[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(14): 17253-17266.

 

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