在自下而上的質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，來自復(fù)雜生物樣品的蛋白質(zhì)被酶解成多肽，然后經(jīng)過多輪質(zhì)譜分析生成譜圖數(shù)據(jù)，解析每張MSn譜中的離子信息，從而得到準(zhǔn)確的產(chǎn)生該譜的多肽氨基酸序列，便是質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析算法研究人員的使命。最初，我們通過手動注釋單個MS2譜圖來解析數(shù)據(jù)，費時費力，對解譜人員的要求也比較高。后來，Sakulai^[1]和Bartels^[2]開發(fā)了早期的從頭測序算法。在過去的幾十年里，多肽從頭測序算法已經(jīng)有了很大的發(fā)展。如今，與許多其他領(lǐng)域一樣，由于引入了深度學(xué)習(xí)方法，多肽從頭測序方法也取得了跨越式進(jìn)展。“深度學(xué)習(xí)”是指任何使用多層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法^[3]。這些方法通常具有大量的可訓(xùn)練參數(shù)，并且需要相應(yīng)的大量訓(xùn)練數(shù)據(jù)。深度學(xué)習(xí)已成功應(yīng)用于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的各個領(lǐng)域，包括預(yù)測碎片離子強(qiáng)度^[4-6]，識別MS1數(shù)據(jù)中的多肽特征峰^[7,8]，對MS2譜圖進(jìn)行大規(guī)模嵌入和聚類^[9]，以及預(yù)測多肽理化性質(zhì)^[5,10-12]。2017年，滑鐵盧大學(xué)的李明院士團(tuán)隊和BSI推出首個用于從頭測序的深度學(xué)習(xí)方法DeepNovo^[13]，此后至少有22種其他深度學(xué)習(xí)方法衍生出來 (表1)。除了其優(yōu)越的性能外，深度學(xué)習(xí)方法在質(zhì)譜分析中得到迅速廣泛應(yīng)用可歸因于三個因素：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)的出現(xiàn)非常適合質(zhì)譜和多肽，硬件的發(fā)展（包括GPU）加速了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的并行計算，以及訓(xùn)練這些模型所需的大規(guī)模公共數(shù)據(jù)的公開^[14-17]。

近日，來自華盛頓大學(xué)計算機(jī)科學(xué)與工程系的William Stafford Noble教授團(tuán)隊發(fā)表了關(guān)于多肽從頭測序的深度學(xué)習(xí)方法的綜述，討論了這些方法的特點，并概述該領(lǐng)域的一些主要應(yīng)用與挑戰(zhàn)。

表1 深度學(xué)習(xí)從頭測序算法列表

（注：表1中引用編號為文獻(xiàn)原文順序）

不同的深度學(xué)習(xí)方法模型

隨著深度學(xué)習(xí)的廣泛應(yīng)用，各種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)也已用于多肽從頭測序。文中作者主要將其分為兩大類進(jìn)行討論：卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Transformer模型。此外，文中還描述了兩種使用深度學(xué)習(xí)對現(xiàn)有從頭測序方法結(jié)果進(jìn)行后處理的方法。

卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）使用滑動窗口處理矢量輸入，其中每個滑動窗口(即“filter”)學(xué)習(xí)識別數(shù)據(jù)中的獨有特征 (圖2a)。CNN在深度學(xué)習(xí)方法的出現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用，部分原因是它提供了強(qiáng)大而通用的模式識別能力，部分原因是它的計算可以通過GPU實現(xiàn)高效運行。首個用于多肽從頭測序的深度學(xué)習(xí)模型DeepNovo^[13]采用了兩個并行模型的迭代解碼過程。根據(jù)訓(xùn)練數(shù)據(jù)的分辨率，使用大小為0.1或0.01 m/z的bin，將訓(xùn)練集中的每張譜圖從m/z軸上分割，轉(zhuǎn)換為向量。這些向量與預(yù)測的prefix整合，產(chǎn)生一個維度為128×26×8×10的張量，其中128是batch size，26是氨基酸種類數(shù)(包括翻譯后修飾[PTMs])， 8是離子類型種類數(shù)（包括b/y離子以及各種中性損失)，10是每個目標(biāo)離子周圍提取的m/z bin的數(shù)量。然后，這個張量經(jīng)過第一個模型ion-CNN處理，譜圖和預(yù)測的peptide prefix作為輸入數(shù)據(jù)，用來預(yù)測下一個氨基酸。第二個模型是一種被稱為“長短期記憶”(LSTM)網(wǎng)絡(luò)的遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(RNN)模型^[18]，以類似于ion-CNN的方法迭代地預(yù)測譜圖中可能存在的氨基酸。

在解碼過程中，ion-CNN和LSTM通過一個單一的、全連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層進(jìn)行連接，該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層輸出一個26維對數(shù)概率向量(logits)。DeepNovo還采用了動態(tài)規(guī)劃后處理器，該后處理器使用預(yù)測logits和knapsack算法來確保預(yù)測多肽的質(zhì)量數(shù)落在實際檢測的母離子容許誤差范圍內(nèi)。作為該領(lǐng)域的首個深度學(xué)習(xí)方法，DeepNovo論文被隨后其他多肽從頭測序的論文廣泛引用(圖1)。

圖1 de novo測序方法引用網(wǎng)絡(luò)圖

DeepNovo-DIA^[2]將DeepNovo模型推廣到DIA數(shù)據(jù)的從頭測序分析。該模型的核心類似于DeepNovo，包括ion-CNN、spectrum-CNN和LSTM。主要區(qū)別在于，由于DIA數(shù)據(jù)可以沿著時間軸組織，并且包含有關(guān)給定分析物的多個相鄰掃描信息，因此DeepNovo-DIA的預(yù)處理步驟涉及檢測3D碎片離子特征和2D母離子特征。在實際應(yīng)用時，需要首先使用外部工具處理DIA MS1數(shù)據(jù)以提取母離子特征，然后通過DeepNovo-DIA模型對每個特征進(jìn)行預(yù)測。

此外，諸如SMSNet、RANovo、PepNet和BiATNovo等算法模型也是借鑒了與DeepNovo類似的思路。

Transformer模型
另一種多肽從頭測序的模型是Transformer架構(gòu)(圖2b)。Transformer最初是為自然語言處理而開發(fā)的，例如語言翻譯 ^[19]。Transformer可以處理不固定長度的輸入，且模型體系結(jié)構(gòu)與輸入信息的順序無關(guān)。因此，通常需要對每個輸入對象的位置進(jìn)行編碼，并將這些編碼的位置與標(biāo)記本身一起提供。這樣就可以消除離散質(zhì)譜m/z軸的相應(yīng)問題。此外transformer的另一個關(guān)鍵特征是能夠自動學(xué)習(xí)輸入特征對之間的重要語義關(guān)系。因此，transformer模型已經(jīng)在DNA和蛋白質(zhì)序列的建模領(lǐng)域獲得了成功應(yīng)用。

Casanovo^[20]使用transformer架構(gòu)將從頭測序視為序列到序列的翻譯任務(wù)，將MS2譜圖中的一系列峰翻譯為一系列氨基酸。該模型包括一個編碼器和一個解碼器。編碼器學(xué)習(xí)輸入MS2譜圖的上下文表示，而解碼器根據(jù)譜圖信息和先前預(yù)測的氨基酸預(yù)測多肽序列中的下一個氨基酸。與其他深度學(xué)習(xí)模型一樣，Casanovo每次預(yù)測多肽序列的一個氨基酸，最終尋找得分最高的預(yù)測序列^[21]。ContraNovo^[22]、π-HelixNovo^[23]、NovoB^[24]、AdaNovo^[25]、InstaNovo^[26]、Cascadia^[27]均采用了類似Casanovo的架構(gòu)，各自加入了不同的特征。

DPST^[28]引入了一組歸納偏差來限制search space。首先，它在貝葉斯環(huán)境中重構(gòu)了從頭測序任務(wù)，其中氨基酸后驗概率是根據(jù)譜圖信息和先驗氨基酸預(yù)測的。將較高的先驗概率給予氨基酸，使母離子質(zhì)量與動態(tài)規(guī)劃計算的預(yù)期多肽質(zhì)量之間的差異最小。其次，DPST編碼器根據(jù)其與相鄰峰的一致性為每個峰分配置信值，優(yōu)先考慮編碼譜中氨基酸質(zhì)量分開的峰。

GraphNovo^[29]包括三個階段的處理。首先，將觀測到的譜圖轉(zhuǎn)換成圖，其中節(jié)點對應(yīng)峰，邊表示峰與峰之間的質(zhì)量關(guān)系。該圖隨后由兩個網(wǎng)絡(luò)依次處理：GraphNovo-PathSearcher和GraphNovo-SeqFiller。前者根據(jù)邊緣編碼的質(zhì)量差產(chǎn)生與部分肽預(yù)測和未解析質(zhì)量標(biāo)簽對應(yīng)的最優(yōu)節(jié)點序列，后者輸出完整氨基酸序列。兩種網(wǎng)絡(luò)都采用了六層Graphormer^[30]編碼器架構(gòu)，該架構(gòu)將tranformer和圖形神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合在一起。

Transformer-DIA^[31]是在DeepNovo-DIA上進(jìn)行擴(kuò)展的，用transformer自關(guān)注計算層取代了譜圖編碼器中的卷積層。在提取與DeepNovo-DIA相同的MS1 profile和理論碎片離子陣列后，該模型使用位置嵌入對連續(xù)MS2掃描的時間信息進(jìn)行編碼，從而允許LSTM解碼被標(biāo)準(zhǔn)transformer解碼層所取代。此外，Transformer-DIA還包括一個類似于Casanovo所采用的beam search解碼程序。

圖2 Transformer模型示意圖
 

其他模型

PointNovo^[32]是DeepNovo同一團(tuán)隊在其基礎(chǔ)上衍生的新架構(gòu)。PointNovo的主要創(chuàng)新在于消除了離散譜圖m/z軸的依賴，從而使模型能夠利用高質(zhì)量精度的數(shù)據(jù)，而無需占用大量內(nèi)存。DeepNovo使用長度為150,000的輸入向量來表示譜圖，而PointNovo則將每張譜圖表示為一組(m/z，intensity)對。該模型采用了一種新穎的體系結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使用了PointNet體系結(jié)構(gòu)^[56]的思想，旨在以一種順序不可知的方式處理一組這樣的元組。與DeepNovo不同，PointNovo的LSTM成分是可選的，盡管經(jīng)驗結(jié)果表明，包括LSTM往往會提供更高質(zhì)量的預(yù)測結(jié)果。PGPointNovo^[33]是PointNovo的改進(jìn)版，支持在多個GPU上并行處理。

還有一些其他模型，如DEPS^[34]使用類似于PointNovo的架構(gòu)，做了一些性能提升。Denovo-GCN^[35]是類似于DeepNovo的模型架構(gòu)。SeqNovo^[36]使用由編碼器和解碼器組成的RNN架構(gòu)^[37]。

數(shù)據(jù)后處理方法

Spectralis^[42]模型旨在通過“bin分類”的輔助任務(wù)來對給定的從頭測序預(yù)測結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。Spectralis模型利用現(xiàn)有的從頭預(yù)測方法(Casanovo和Novor)做出的預(yù)測，將其轉(zhuǎn)化為更準(zhǔn)確的預(yù)測。其中作者還提出了一種方法，Spectralis-score，用于使用機(jī)器學(xué)習(xí)后處理器重新校準(zhǔn)Novor和Casanovo的分?jǐn)?shù)。

算法性能評估標(biāo)準(zhǔn)
許多從頭測序方法借用了precision（精度）和recall（召回率）的概念，但附加了一些特殊的定義。尤其是由于de novo測序不是一個二元分類任務(wù)，因此傳統(tǒng)的真陽性（TP）、假陽性（FP）、真陰性（TN）和假陰性（FN）分類并不適用。對于de novo，只有三種分類：高于閾值的預(yù)測為“正確”或“不正確”，低于閾值的預(yù)測為“不可預(yù)測”(圖3a)。使用這些分類方法，我們可以做出如下新的定義：

（C 是正確預(yù)測的譜圖數(shù)量，I是不正確預(yù)測的譜圖數(shù)量，U是不可預(yù)測的譜圖數(shù)量）

這種precision（精度）的替代定義與來自二進(jìn)制分類設(shè)置的傳統(tǒng)定義一致，后者是分?jǐn)?shù)大于指定分?jǐn)?shù)閾值的預(yù)測的正確比例。然而，recall（召回率）的定義則不同。在二元分類設(shè)置中，“召回率”是帶有正確標(biāo)簽的樣本被正確預(yù)測為正的比例，新的定義是被正確預(yù)測的全部樣本的比例。因此，使用替代定義的precision-recall曲線與傳統(tǒng)precision-recall曲線有質(zhì)的不同。特別是，當(dāng)閾值移動到排名列表的最末尾時，U的值變?yōu)榱�，此時精度和召回率相等。因此，采用上述替代定義的precision-recall曲線終止于x = y線，而傳統(tǒng)的precision-recall曲線終止于x = 1, y等于數(shù)據(jù)集中陽性預(yù)測的比例(圖3b)。

為了避免這種術(shù)語混淆，一些從頭測序的研究采用了precision-coverage曲線，其中precision的定義如上所述，但coverage的定義是分?jǐn)?shù)大于某個閾值的預(yù)測的比例，而不管預(yù)測是否正確, 這樣生成的曲線總是終止于x = 1(圖3C)。

圖3 肽段召回率和覆蓋度曲線
 

DeepNovo原始論文中使用的九種基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，采用的是統(tǒng)計在特定精度閾值(95%或99%)下正確預(yù)測的譜圖數(shù)量的方法^[13]。該基準(zhǔn)在隨后的研究中被廣泛使用^{[43-46,23-25，47-48]}。然而存在的問題是，這種簡單的譜圖水平分類方法并不能確保訓(xùn)練集中的多肽序列不會出現(xiàn)在測試集中。因此，如果機(jī)器學(xué)習(xí)算法“記憶”了訓(xùn)練集中序列的特征，那么在處理測試集中相同肽段產(chǎn)生的譜圖時，就會帶來不公平的優(yōu)勢。為了避免這個問題，一些研究選擇了多肽水平的分類，從而防止序列信息從訓(xùn)練集泄漏到測試集。但是這種情況不考慮PTMs，因為同一條肽段的修飾譜與非修飾譜極為相似。
然而，即使在多肽水平考慮，如果訓(xùn)練集和測試集都包含由同一多肽產(chǎn)生的譜圖，也難以避免會產(chǎn)生算法“記憶”導(dǎo)致的偏好。因此，適當(dāng)?shù)挠?xùn)練/測試設(shè)置應(yīng)確保訓(xùn)練集和測試集在任何一種意義上都不重疊。

不同算法性能比較
表1列舉了23種深度學(xué)習(xí)多肽從頭測序的方法，那問題是“哪種方法效果最好?”然而，由于不同的算法使用的評估指標(biāo)、訓(xùn)練數(shù)據(jù)集、測試數(shù)據(jù)集等都不盡相同，沒辦法絕對的說哪個好，哪個不好，只能說在不同的場景下，哪種方法更適合。例如，具有數(shù)百萬個參數(shù)的模型在數(shù)百萬個PSMs規(guī)模上訓(xùn)練時可能表現(xiàn)最佳，而在相對較小的數(shù)據(jù)集上訓(xùn)練時就不如人意了。此外，如AdaNovo^[25]，其重點是改進(jìn)PTM預(yù)測，可能只有在相應(yīng)的數(shù)據(jù)集中才能得到較好的預(yù)測效果。

在實踐中，每項研究通常都會與少數(shù)其他方法進(jìn)行比較，從圖1中的引用圖便可看出。顯然系統(tǒng)的基準(zhǔn)研究才更有意義，其中所有模型都在相同的數(shù)據(jù)上進(jìn)行訓(xùn)練，并在具有明確定義的度量的獨立測試數(shù)據(jù)上進(jìn)行評估。下面列舉兩項外部數(shù)據(jù)上評估從頭測序方法的研究。

首先，Beslic等[49]比較了Novor、pNovo3、DeepNovo、SMSNet、PointNovo和Casanovo在抗體發(fā)現(xiàn)從頭測序分析上的表現(xiàn)。為了避免使用不同的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集造成的偏差，他們首先在MassIVE-KB人類譜圖庫上重新訓(xùn)練了上述6種模型 [50]。通過對人類和小鼠抗體數(shù)據(jù)的評估，結(jié)果顯示，Casanovo和PointNovo在不同酶和數(shù)據(jù)集上顯示出更高的肽段召回率。

第二項研究中，Tran等人^[51]在人類酶切、人非酶切、擬南芥，HLA-I型和Prosit生成的模擬數(shù)據(jù)的5個數(shù)據(jù)集上評估了PEAKS、PointNovo、Casanovo和GraphNovo。與之前的基準(zhǔn)測試工作相反，不對模型進(jìn)行重新訓(xùn)練，而是直接使用。因為所有工具最初都是在人類數(shù)據(jù)上進(jìn)行訓(xùn)練的，所以它們在人類測試數(shù)據(jù)上也取得了最好的預(yù)測結(jié)果。然而，當(dāng)對擬南芥數(shù)據(jù)進(jìn)行評估時，性能有所下降，表明測試集與訓(xùn)練集完全不同時，算法上還是存在一些不通用性的�？偟膩碚f，Casanovo和GraphNovo在所有評估數(shù)據(jù)集中都取得了最佳的預(yù)測效果。

深度學(xué)習(xí)從頭測序方法的應(yīng)用
由于許多從頭測序方法都是近幾年發(fā)表的，所以應(yīng)用范圍并不是很廣，然而，表1列舉的方法中，也有幾種相對來說具有比較明確的應(yīng)用方向。其中，DeepNovo應(yīng)用最為廣泛。DeepNovo方法及其后續(xù)方法PointNovo已被納入商業(yè)軟件PEAKS中，表2列舉的應(yīng)用案例中的大多數(shù)都使用了PEAKS。在表2所有27項應(yīng)用案例中，最常見的應(yīng)用是檢測新生抗原和非典型抗原，其次是抗體測序,毒液蛋白組和宏蛋白質(zhì)組。其次，還有些研究通過從頭測序研究短肽。隨著該領(lǐng)域軟件工具質(zhì)量的不斷提升，未來，de novo測序的應(yīng)用可能會擴(kuò)展到其他領(lǐng)域。

表2 深度學(xué)習(xí)從頭測序方法的主要應(yīng)用

（注：表2中引用編號為文獻(xiàn)原文順序）

挑戰(zhàn)

圖4 錯誤的肽段標(biāo)簽

此外，作者在一系列不同質(zhì)量的數(shù)據(jù)集上評估了預(yù)訓(xùn)練的Casanovo模型，每個數(shù)據(jù)集包含20,000張譜圖。結(jié)果如圖5，模型的表觀性能如何取決于用于評估的數(shù)據(jù)的質(zhì)量:隨著總離子強(qiáng)度的降低，肽段平均精度變化從0.99也隨之降到0.84，再到0.37。如果采用不同質(zhì)量的數(shù)據(jù)集進(jìn)行訓(xùn)練，這種現(xiàn)象應(yīng)該會更加明顯。

圖5 高質(zhì)量PSMs預(yù)測更準(zhǔn)確

第三種方法是使用FDR的統(tǒng)計方法，這也是評估數(shù)據(jù)庫搜索算法的標(biāo)準(zhǔn)方法。比如，如果在固定的FDR閾值(例如1%)下，A從同一組譜圖中檢測到比B更多的肽，則認(rèn)為方法A比方法B更好。但目前，還沒有成熟的用于從頭測序結(jié)果的FDR評估方法，開發(fā)新的FDR方法是該領(lǐng)域最關(guān)鍵的挑戰(zhàn)之一。不久前，Tran等[50]提出來一種解決方案。

評估從頭測序方法的另一個挑戰(zhàn)是嵌合譜的存在，以一種全新的方式預(yù)測嵌合譜是具有挑戰(zhàn)性的，而評估這種預(yù)測則更加復(fù)雜。另一個重要的復(fù)雜因素是PTMs。為了包括新的PTMs和擴(kuò)展氨基酸字母表，大多數(shù)從頭測序工具必須完全重新訓(xùn)練，納入包括這些新的PTMs的額外數(shù)據(jù)。然而許多與生物學(xué)相關(guān)的PTMs含量低且為可變的，就導(dǎo)致很難收集到足夠的訓(xùn)練數(shù)據(jù)。識別包含多種PTMs的多肽仍然是深度學(xué)習(xí)從頭測序工具的一個巨大挑戰(zhàn)。

目前，深度學(xué)習(xí)從頭測序的方法通常以自回歸的方式生成肽，按順序預(yù)測每個氨基酸。這種方法存在的問題是如果前序氨基酸發(fā)生了預(yù)測錯誤，無法進(jìn)行糾正，或者長肽中存在不連續(xù)碎片峰時無法進(jìn)行預(yù)測，并且由于自回歸解碼不能并行化，因此計算效率很低。

最后，在對新工具進(jìn)行評價時，一個經(jīng)常被忽視的方面是基準(zhǔn)測試的實際實施，特別是涉及到對相同數(shù)據(jù)的再訓(xùn)練時。為了確保每個模型的最佳訓(xùn)練條件，訓(xùn)練過程可能需要針對這個特定的數(shù)據(jù)集進(jìn)行調(diào)整。另外，原始方法提出的默認(rèn)超參數(shù)可能不是最優(yōu)的，導(dǎo)致性能降低并影響基準(zhǔn)測試結(jié)果。

盡管這個領(lǐng)域面臨著許多挑戰(zhàn)，但都是可以通過算法的進(jìn)步逐一克服的。自DeepNovo引領(lǐng)性論文發(fā)表以來，這一領(lǐng)域的發(fā)展相當(dāng)迅速。隨著新的機(jī)器學(xué)習(xí)策略、越來越多的公開可用數(shù)據(jù)和質(zhì)譜儀器的性能提升，從頭測序工具的使用將變得更加普遍，使許多具有挑戰(zhàn)性或不可能進(jìn)行的分析成為可能。

彩蛋
如上所述，多肽從頭測序的各種方法通常是用一些簡單的指標(biāo)來評估測序結(jié)果，但這些指標(biāo)并不能完全反映它們的總體性能。而迄今為止，還沒有一種方法可以用來評估de novo PSM的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)和顯著性。針對這一局限，BSI開發(fā)了全面的NovoBoard模型框架，來評估de novo sequencing方法的性能。該框架涵蓋了不同的基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集(包括酶切、非酶切、免疫肽組學(xué)和不同物種數(shù)據(jù))，以及一套用于de novo結(jié)果碎片離子、氨基酸和肽段準(zhǔn)確度的評估標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，NovoBoard創(chuàng)新性地基于target-decoy對de novo peptide sequencing方法進(jìn)行評估，并計算其FDR。我們綜合評估了PEAKS de novo、PointNovo、Casanovo和GraphNovo方法在特定應(yīng)用場景和數(shù)據(jù)類型下的性能，結(jié)果表明，GraphNovo總體表現(xiàn)優(yōu)于其他方法。Novoboard方法文章已上線Biorxiv。

什么，算法太復(fù)雜了看不懂？不用擔(dān)心，我們已將相關(guān)算法應(yīng)用到最新的PEAKS 12系列軟件中，只需將待分析的數(shù)據(jù)提交給PEAKS，分析完直接看結(jié)果就好啦，并且可以借助PEAKS優(yōu)秀的可視化界面對譜圖進(jìn)行手動校驗。欲了解軟件詳情或者申請軟件試用，可通過如下聯(lián)系方式咨詢我們~。

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