近年來(lái)，為更快地將創(chuàng)新療法帶給患者，加快藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)程已成為生物制藥行業(yè)的主要關(guān)注點(diǎn)。重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 （CHO） 細(xì)胞系是單克隆抗體 （mAb） 的主要表達(dá)系統(tǒng)，為了加快生物制藥進(jìn)程，如何提高宿主細(xì)胞外源基因表達(dá)量及穩(wěn)定性水平是個(gè)棘手的熱門話題，目前通常通過(guò)將遺傳信息隨機(jī)轉(zhuǎn)基因整合 （RTI：Random Transgene Integration）到宿主細(xì)胞基因組中產(chǎn)生，即通過(guò)選擇性標(biāo)記進(jìn)行多輪篩選以獲得具有高表達(dá)水平的克隆。而由于缺乏對(duì)隨機(jī)整合插入位點(diǎn)的控制，部分克隆細(xì)胞系的重組蛋白生產(chǎn)力可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少，導(dǎo)致細(xì)胞系不穩(wěn)定。因此，RTI代表了一種容易出錯(cuò)且乏味的方法，導(dǎo)致開(kāi)發(fā)時(shí)間很長(zhǎng)。定點(diǎn)整合 （SSI：Site-Specific Integration） 被確定為 RTI的一種有前途的替代品，因?yàn)樗�可以更快速地生成高性能和穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系，加速藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)程。
 

RTI技術(shù)與SSI技術(shù)區(qū)別
 

基于RTI（上圖）與SSI（下圖）的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程圖示^[1]
 

在基于RTI的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中，攜帶轉(zhuǎn)基因遺傳信息和選擇標(biāo)記的線性化質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到CHO宿主細(xì)胞的基因組中。因此，具有不可預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的多拷貝轉(zhuǎn)基因整合將發(fā)生在未知基因組位點(diǎn)上，代謝選擇后產(chǎn)生的細(xì)胞庫(kù)顯示出高水平的基因組和表型多樣性。對(duì)于基于SSI的CLD，能夠在基因組的特定位點(diǎn)精確插入或整合外源DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的添加、刪除或替換，可使得細(xì)胞庫(kù)顯示出較低的表型異質(zhì)性。相比于RTI，SSI具有高整合效率、外源基因可實(shí)現(xiàn)精確定位、基因表達(dá)具有一致性、減少位置效應(yīng)使得基因表達(dá)受控、提高細(xì)胞株的安全性及簡(jiǎn)化篩選流程等優(yōu)勢(shì)。
 

常見(jiàn)的SSI技術(shù)方法

1、 CRISPR-Cas系統(tǒng)：

利用CRISPR-Cas9或其他變體，結(jié)合特異性向?qū)�RNA（sgRNA），在基因組中特定位置切割DNA，并通過(guò)同源重組修復(fù)（HDR）或非同源末端連接（NHEJ）插入外源DNA。

2、 轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)：

如Sleeping Beauty、piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，通過(guò)轉(zhuǎn)座酶在特定位置插入外源基因。

3、 重組（整合）酶系統(tǒng)：

如BxB1、Cre-LoxP、FLP-FRT和PhiC31等系統(tǒng)，通過(guò)特異性識(shí)別序列進(jìn)行重組，實(shí)現(xiàn)外源DNA的整合。
 

重組酶系統(tǒng)01  BxB1整合酶定點(diǎn)整合外源基因

Gaidukov L, Wroblewska L等人^[2]2018年發(fā)表于Nucleic Acids Research的文章，確定了21個(gè)支持轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)的新基因組位點(diǎn)，然后在選定的位點(diǎn)構(gòu)建了包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)“著陸墊”重組位點(diǎn)的細(xì)胞系。通過(guò)在每個(gè)位點(diǎn)使用高效的BxB1重組酶以及不同的選擇標(biāo)記，將重組酶介導(dǎo)的異源DNA插入到選定的位點(diǎn)，包括通過(guò)單次轉(zhuǎn)染靶向所有三個(gè)位點(diǎn)。使用這種方法可控地整合多達(dá)9個(gè)拷貝的單克隆抗體，代表21個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中約100 kb的異源DNA。由于整合針對(duì)預(yù)先驗(yàn)證的位點(diǎn)，重組蛋白表達(dá)在數(shù)周內(nèi)保持穩(wěn)定，并且整合有效載荷中抗體盒的額外拷貝導(dǎo)致抗體表達(dá)線性增加。總體而言，該多拷貝位點(diǎn)特異性整合平臺(tái)允許將大量DNA可控且可重復(fù)地插入穩(wěn)定的基因組位點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物合成生物學(xué)、重組蛋白生產(chǎn)和生物制造方面具有廣泛的應(yīng)用。

 

BxB1整合酶定點(diǎn)整合外源基因

 

02  FLP/FRT重組酶定點(diǎn)整合外源基因

Feary M, Moffat MA等人^[3]在2021年發(fā)表于Biotechnology Progress的文章， 將Fer1L4位點(diǎn)與CHOK1SV谷氨酰胺合成酶敲除 （GS-KO） 宿主相結(jié)合，創(chuàng)建了一個(gè)改進(jìn)的CHOK1SV GS-KO 定點(diǎn)整合表達(dá)系統(tǒng)。CHOK1SV GS-KO SSI宿主是通過(guò)同源定向整合Fer1L4基因中不相容的Frt序列的靶向著陸墊創(chuàng)建的，靶向載體包含無(wú)啟動(dòng)子GS表達(dá)盒和mAb表達(dá)盒，兩側(cè)是與宿主細(xì)胞系中著陸墊兩側(cè)的等效位點(diǎn)兼容的Frt 位點(diǎn)。
 

FLP/FRT重組酶定點(diǎn)整合外源基因圖示

 

03  Cre/Lox重組酶定點(diǎn)整合外源基因

Zhou M, Crawford Y等人^[4]在2021年發(fā)表于Biotechnology Progress的文章，利用Cre/Lox重組酶介導(dǎo)的盒式交換（RMCE）將表達(dá)抗體的盒引入預(yù)定位點(diǎn)，建立了CHO-K1-M衍生的SSI宿主細(xì)胞。兩個(gè)SSI宿主細(xì)胞都包含一個(gè)表達(dá)GFP的著陸墊，兩側(cè)是兩個(gè)不兼容的LoxP重組位點(diǎn)（L3和2L）。此外，在GFP著陸墊中插入了第三個(gè)不相容的LoxP位點(diǎn)（LoxFAS），以實(shí)現(xiàn)基于雙質(zhì)粒的創(chuàng)新RMCE策略，其中兩個(gè)獨(dú)立的載體可以同時(shí)靶向單個(gè)位點(diǎn)。

 

Cre/Lox重組酶定點(diǎn)整合外源基因圖示
 

目前，已有一些知名制藥企業(yè)（武田制藥、羅氏、強(qiáng)生等）利用智能定點(diǎn)整合技術(shù)優(yōu)化其生物藥物的生產(chǎn)流程，包括開(kāi)發(fā)穩(wěn)定細(xì)胞株用于大規(guī)模生產(chǎn)。而利用整合酶定點(diǎn)整合外源基因的方式對(duì)于國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)來(lái)說(shuō)目前還是處于萌芽階段。但定點(diǎn)整合技術(shù)對(duì)抗體藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)的前景是可預(yù)期的，眾多生物制藥企業(yè)一直期盼能盡快將定點(diǎn)整合應(yīng)用于自身平臺(tái)中，加速細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)。
 

案例分享（以重組酶系統(tǒng)為例）

通過(guò)定點(diǎn)整合技術(shù)，將目標(biāo)基因序列通過(guò)同源重組的方式轉(zhuǎn)染到已經(jīng)通過(guò)前期篩選驗(yàn)證過(guò)的活躍位點(diǎn)當(dāng)中，構(gòu)建均一細(xì)胞池。其首先需要構(gòu)建平臺(tái)細(xì)胞，利用報(bào)告基因（如GFP 等） 篩選得到宿主細(xì)胞基因組中的高表達(dá)位點(diǎn)，之后利用重組酶的特異性，實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)產(chǎn)品基因插入在該表達(dá)量高、質(zhì)量和表達(dá)量穩(wěn)定的宿主細(xì)胞基因組位點(diǎn)，再利用Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定及高產(chǎn)的單克隆細(xì)胞株。

定點(diǎn)整合單克隆篩選流程

 

細(xì)胞類型：CHO-K1

細(xì)胞狀態(tài)：35%陽(yáng)性率；80%活率

單細(xì)胞挑選設(shè)備：Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)，對(duì)照組：FACS

單細(xì)胞、單克隆率：
 

通過(guò)無(wú)熒光轉(zhuǎn)化子同源同組，細(xì)胞樣品內(nèi)有帶有熒光的母細(xì)胞也有無(wú)熒光即轉(zhuǎn)化子同組成功的目的細(xì)胞，12天后采用Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)熒光細(xì)胞鋪板（只分選非熒光的細(xì)胞），單細(xì)率約為85%，克隆恢復(fù)率約為20%，而對(duì)照組流式由于分選過(guò)程對(duì)單細(xì)胞狀態(tài)及活力造成損傷，后續(xù)單細(xì)胞難以恢復(fù)成克隆。此流程可以省去minipool與有限稀釋的環(huán)節(jié)，加快開(kāi)發(fā)流程，值得一提的是，用定點(diǎn)整合方式，經(jīng)單細(xì)胞打印系統(tǒng)分選獲得的單克隆，后續(xù)產(chǎn)量＞5g/L，約為隨機(jī)整合表達(dá)量的1.5-2倍，此流程可降低開(kāi)發(fā)時(shí)間和成本，提升開(kāi)發(fā)效能，大大縮短整個(gè)工藝開(kāi)發(fā)及IND申報(bào)時(shí)間。

 

智能定點(diǎn)整合技術(shù)在單克隆細(xì)胞株篩選中具有高效、精確和安全等顯著優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然其也面臨技術(shù)復(fù)雜、成本高以及潛在脫靶效應(yīng)等挑戰(zhàn)，選擇使用SSI技術(shù)需綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、成本和技術(shù)能力等因素。
 

參考資料

[1] Schmieder V , Fieder J , Drerup R ,et al.Towards maximum acceleration of monoclonal antibody development: Leveraging transposase-mediated cell line generation to enable GMP manufacturing within 3 months using a stable pool[J].Journal of Biotechnology, 2022(349-):349.DOI:10.1016/j.jbiotec.2022.03.010.

[2] A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cell engineering. Nucleic Acids Res.Gaidukov L, Wroblewska L, Teague B, Nelson T, Zhang X, Liu Y, Jagtap K etc.(2018)

[3]CHOK1SV GS-KO SSI expression system: A combination of the Fer1L4 locus and glutamine synthetase selection. Biotechnol Prog.Feary M, Moffat MA, Casperson GF, Allen MJ, Young RJ.(2021)

[4]Development of a targeted integration Chinese hamster ovary host directly targeting either one or two vectors simultaneously to a single locus using the Cre/Lox recombinase-mediated cassette exchange system. Biotechnol Prog. Ng D, Zhou M, Zhan D, Yip S, Ko P, Yim M, etc.(2021)