文獻信息
北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室、貴州大學醫(yī)學院等團隊合作的研究成果Construction and Preclinical Evaluation of ¹²⁴I/¹²⁵I‑Labeled Antibody Targeting T Cell Immunoglobulin and Mucin Domain‑3（靶向T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域-3的¹²⁴I/¹²⁵I標記抗體的構建及臨床前評估）在學術期刊《Molecular Pharmaceutics》發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova）產品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

 該研究的通訊作者為北腫楊志主任，朱華研究員以及趙傳科副教授。第一作者為淘金萍同學，曾子晴醫(yī)師以及何成雪同學。

文獻背景
摘要:T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域3 (TIM3;HAVCR2)是一種跨膜蛋白，對T細胞反應施加負調節(jié)控制。研究表明，TIM3在腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)中的表達上調。本研究利用雜交瘤技術制備了一系列靶向TIM3的單克隆抗體。其中，C23表現出良好的生物學特性。為了實現特異性結合，作者通過n -溴琥珀酰亞胺(NBS)介導的單克隆抗體C23標記開發(fā)了¹²⁴I/¹²⁵I-C23放射性示蹤劑。使用過表達TIM3的293T-TIM3細胞系和親本293T細胞評估結合親和力和特異性。在HEK293TIM3異種移植模型和4T1-(小鼠乳腺癌細胞)和CT26(小鼠結腸癌細胞)異體移植模型中檢測¹²⁴I/¹²⁵I-C23的生物分布和體內成像。分別在3.7~7.4 MBq ¹²⁴I-C23靜脈給藥后4、24、48、72和/或96小時對模型小鼠進行微PET/CT成像。此外，對解剖腫瘤器官中TIM3的表達進行免疫組化(IHC)染色，并評估腫瘤中相應的程序性死亡1 (PD1)、CD3和CD8的表達。C23單克隆抗體(mAb)特異性結合TIM3蛋白，解離常數為23.28 nM。成功制備了¹²⁴I-C23和¹²⁵I-C23示蹤劑，標記率分別為83.59±0.35%和92.35±0.20%，放射化學純度超過95.00%。穩(wěn)定性結果表明，¹²⁴I/¹²⁵I-C23在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和5%人血清白蛋白(HSA)中的放射化學純度在96 h后仍>80%，293T-TIM3細胞對¹²⁵I-C23的攝取為2.80±0.12%，顯著高于293T細胞(1.08±0.08%)，阻斷組在60和120 min時均顯著阻斷293T-TIM3細胞對¹²⁵I-C23的攝取。體內藥代動力學分析顯示，¹²⁵I-C23的消除時間為14.62h，分布時間為0.4672h。顯微PET/CT成像顯示，293T-TIM3模型¹²⁴I-C23探針攝取與陰性對照組和阻斷組的探針攝取有顯著差異。在人源化小鼠模型中，¹²⁴I-C23探針在4T1和CT26模型中有明顯的特異性攝取，24h時在腫瘤組織中有最大的攝取(4T1和CT26人源化TIM3小鼠腫瘤模型的SUVmax(最大標準化攝取值)分別為0.59±0.01和0.76±0.02)。來自這些小鼠模型的腫瘤組織的免疫組織化學顯示相似的TIM3表達。TIM3表達的腫瘤組織中也有CD3、CD8細胞和PD-1的表達。TIM3靶向抗體C23具有良好的親和力和特異性。¹²⁴I/¹²⁵I-C23探針在體外和體內對TIM3具有明顯的靶向特異性。作者的結果表明¹²⁴I/¹²⁵I-C23是一種很有前途的TIM3成像示蹤劑，在監(jiān)測免疫檢查點藥物療效方面可能具有很大的潛力。

實驗方法
動物異種移植物模型和顯微PET/CT成像
所有動物實驗均經北京大學腫瘤醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。本研究使用健康雌性NOD SCID、BALB/c-nu和KM小鼠均為4~6周齡，TIM3人源化BALB/c小鼠。采用NOD SCID小鼠接種3×10⁶個293T/293T-TIM3細胞構建293T/293T-TIM3異種移植模型，BALB/c-nu小鼠接種3×10⁶個A549-TIM3細胞構建A549-TIM3異種移植模型，BALB/c小鼠(hTIM3)右腋窩接種4T1或CT26細胞建立異種移植模型。當腫瘤體積達到約0.5−1cm³時，進行動物實驗。在0.5%碘化鉀 (KI)溶液阻斷甲狀腺后，異種移植模型和同種異體移植模型通過尾靜脈注射124I-C23 (3.7-7.4 MBq)。然后在不同的時間點進行靜態(tài)PET掃描15分鐘。重建顯微PET數據。最大標準化攝取值(SUVmax)是通過描述每個器官的感興趣區(qū)域(ROI)來估計的。

實驗結果
將¹²⁴I標記的C23單克隆抗體注射到293T和293T-TIM3荷瘤小鼠體內，進行微PET/CT成像。在阻斷組中，除¹²⁴I-C23外，向攜帶293T-TIM3的小鼠注射過量的C23抗體。通過正電子發(fā)射斷層掃描(PET)圖像描繪293T和293T-TIM3模型小鼠各器官的ROI，并獲得SUVmax。¹²⁴I-C23被肝臟代謝，更多分布于血管化程度較高的器官，如肝臟和肺(圖4B−4D)，這與生物分布研究的結果一致。與陰性對照組和阻斷組相比，實驗組293T-TIM3腫瘤組織對探針有明顯的攝取(圖4A)。此外，注射后24h, 293T-TIM3模型腫瘤的SUVmax與阻斷組的SUVmax相比有顯著差異(0.46±0.0047 vs 0.40±0.0163 vs 0.36±0.0082,P < 0.01)(圖4B−4D)。

圖4.腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射¹²⁴I-C23探針后4、24、48、96 h對293T/293T-TIM3異種移植模型進行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。(B)注射¹²⁴I-C23后不同時間點293T-TIM3模型小鼠各器官的SUVmax;(C)注射¹²⁴I-C23后不同時間點293T模型小鼠各臟器的SUVmax;(D) ¹²⁴I-C23和100mg/kgC23阻斷后293T-TIM3模型小鼠各器官不同時間點的SUVmax。
 

將¹²⁴I-C23注射到A549-TIM3模型進行顯微PET/CT成像(圖5A)，注射后2h測得最高攝量 (SUVmax=0.89±0.0163);此外，A549-TIM3模型的代謝與293T-TIM3模型的代謝一致(圖4A)。此外，A549和A549-TIM3腫瘤區(qū)域的¹⁸F-FDG顯微PET/CT成像顯示SUVmax無顯著差異(圖5B)。

圖5. 腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射124I-C23探針后2、24、48、72、96 h對A549-TIM3異種移植模型進行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位;(B)注射¹⁸F-FDG探針60min后，用Micro-PET/CT對A549/A549-TIM3異種移植模型進行成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。

文獻結論
在這項研究中，TIM3被證明是預測性生物標志物的可行靶點，而¹²⁵I-C23的體內生物分布和藥代動力學研究可能有助于更好地了解免疫治療反應。¹²⁴I-C23的Micro PET/CT成像顯示出良好的腫瘤背景攝取和靶向特異性，這為進一步研究¹²⁴I/¹²⁵I-C23和其他TIM3預測性生物標志物提供了支持。在未來，免疫治療生物標志物成像可用于治療監(jiān)測和患者分層。

使用設備

   
Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）