文獻(xiàn)信息

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學(xué)科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等團(tuán)隊(duì)合作的研究成果"Screening, Construction, and Preliminary Evaluation of CLDN18.2-Specific Peptides for Noninvasive Molecular Imaging"（CLDN18.2無創(chuàng)分子成像特異性肽的篩選、構(gòu)建和初步評價(jià)）在學(xué)術(shù)期刊《ACS Pharmacology & Translational Science》（JCR Q1, SCI IF 6.0）發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物PET/CT（型號：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

 

該研究的通訊作者為北腫朱華研究員。第一作者為王紫蕾同學(xué)和趙傳科副教授。

文獻(xiàn)背景
最近的全球臨床試驗(yàn)表明，CLDN18.2是治療胃癌的理想靶點(diǎn)，CLDN18.2高表達(dá)的患者可以從靶向治療中獲益。因此，準(zhǔn)確、全面地檢測CLDN18.2的表達(dá)對患者篩查和指導(dǎo)抗CLDN18.2治療具有重要意義。利用噬菌體展示技術(shù)從1000億個(gè)文庫中篩選CLDN18.2特異性肽。293T^CLDN18.2細(xì)胞用于排除非特異性結(jié)合序列和CLDN18.2結(jié)合序列，293T^CLDN18.2細(xì)胞用于篩選CLDN18.2特異性結(jié)合肽。對噬菌體篩選獲得的單克隆進(jìn)行測序，并根據(jù)測序結(jié)果合成多肽。用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)肽評估結(jié)合特異性和親和力。還合成了1,4,7,10 - 四氮雜環(huán)十二烷 - 1,4,7,10 - 四乙酸(DOTA)偶聯(lián)肽，用于⁶⁸Ga放射性標(biāo)記。并對其體外和體內(nèi)穩(wěn)定性、分配系數(shù)、體內(nèi)分子成像和生物分布進(jìn)行了表征。經(jīng)過噬菌體展示篩選，共篩選出54個(gè)單克隆克隆。隨后，根據(jù)細(xì)胞ELISA結(jié)果，選擇CLDN18.2偏好單克隆進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)測序，序列比對得到4條7肽序列;其中，一種名為T37的肽在體外和體內(nèi)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。T37肽特異性識(shí)別CLDN18.2，但不能識(shí)別CLDN18.1，并與CLDN18.2陽性細(xì)胞膜緊密結(jié)合。⁶⁸Ga-DOTA-T37探針具有良好的體外性能和高的親水穩(wěn)定性;具有較高的生物安全性，正電子發(fā)射斷層掃描/計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET/CT)研究表明，它可以特異性靶向小鼠的CLDN18.2蛋白和CLDN18.2陽性腫瘤。⁶⁸Ga-DOTA-T37顯示了在PCT/CT成像中使用CLDN18.2特異性探針的優(yōu)越性和可行性，值得進(jìn)一步開發(fā)和利用。

 
實(shí)驗(yàn)方法
微PET/CT成像
將7.4MBq/200μL的⁶⁸Ga-DOTA-T37 (⁶⁸Ga-DOTA-T25,⁶⁸Ga-DOTA-T9和⁶⁸Ga-DOTA-T51) 經(jīng)尾靜脈注射到模型小鼠體內(nèi)，異氟烷 (2-3%，1L/min氧氣) 麻醉后置于加熱床上，用微PET/CT成像掃描儀 (Super Nova PET/CT 平生醫(yī)療科技有限公司) 靜態(tài)獲取PET/CT圖像。將感興趣區(qū)域 (ROI) 繪制在CT圖像上，并映射到PET上，進(jìn)一步獲取其SUVmax并進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
微型PET/CT成像。PET/CT成像可以無創(chuàng)地實(shí)時(shí)評估⁶⁸Ga-DOTA-T37在體內(nèi)的分布和代謝特征。為快速檢測⁶⁸Ga-DOTA-T37對CLDN18.2的特異性，正常KM小鼠右腋窩注射20μg CLDN18.2蛋白成像，對側(cè)注射等體積生理鹽水。注射后15~120分鐘內(nèi)顯示最大強(qiáng)度投影(MIP)圖像，小鼠右腋下明顯攝入探針(圖5A)。繪制PET圖像中感興趣區(qū)域(ROI)的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax)，結(jié)果顯示蛋白注射部位探針明顯高于對照組，在15min時(shí)攝取值最高(0.48±0.01)，隨后隨時(shí)間降低(圖5B)。構(gòu)建BGC823和BGC823^CLDN18.2荷瘤小鼠，評估⁶⁸Ga-DOTA-T37對CLND18.2陽性腫瘤的識(shí)別能力，結(jié)果顯示，注射后30分鐘，探針在PET圖像上清晰地描繪了BGC823^CLDN18.2腫瘤組織，但未顯示探針被BGC823荷瘤小鼠的腫瘤組織特異性攝取(圖5C)。注射后30min獲得最佳造影劑PET圖像，BGC823和BGC823^CLDN18.2腫瘤部位的SUVmax值分別為0.24±0.004和0.38±0.008。此外，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，探針在兩種腫瘤中的攝取值有顯著差異(圖5D)。

圖5 ⁶⁸Ga-DOTA-T37的體內(nèi)表征。(A) CLDN18.2蛋白注射模型小鼠⁶⁸Ga-DOTA-T37顯微PET/CT成像。紅色箭頭指向蛋白質(zhì)注射部位。(B) CLDN18.2蛋白注射部位與對側(cè)生理鹽水注射部位的SUVmax比較。(C) ⁶⁸Ga-DOTA-T37在BGC823和BGC823^CLDN18.2荷瘤小鼠體內(nèi)的PET微成像。白色虛線框代表腫瘤。(D)荷瘤小鼠腫瘤部位SUVmax的比較。

文獻(xiàn)結(jié)論
本研究采用噬菌體展示肽洗脫技術(shù)，經(jīng)過4輪生物篩選獲得CLDN18.2特異性7肽T37，構(gòu)建核素探針⁶⁸GaDOTA-T37。在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了T37對CLDN18.2的特異性和親和力。器官的蘇木精和伊紅(HE)染色結(jié)果和人體輻射的低吸收劑量證明了探針的安全性。CLDN18.2蛋白模型和荷瘤模型的PET/CT成像表明，⁶⁸GaDOTA-T37探針在體內(nèi)特異性靶向CLDN18.2陽性組織和腫瘤。綜上所述，⁶⁸Ga-DOTA-T37是一種值得進(jìn)一步開發(fā)利用的CLDN18.2特異性核素分子探針。

使用設(shè)備

  
Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）