MeRIP-seq揭示METTL3介導m6A修飾增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制細胞衰老
老年骨質疏松癥主要由成骨細胞功能衰減引起，進而導致骨量減少和骨重塑過程破壞。目前許多研究表明m6A修飾在骨質疏松癥的調控中發(fā)揮著重要作用，但大多數研究集中在骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A對成骨細胞的直接調控機制尚不清楚。
蘭州大學第二醫(yī)院骨科夏亞一教授和耿彬教授合作，在老年骨質疏松癥患者中揭示了m6A修飾和甲基轉移酶樣3（METTL3）表達降低。進一步體外實驗表明，METTL3抑制了成骨細胞衰老，而成骨細胞功能障礙會影響骨代謝平衡。隨后MeRIP-seq和mRNA-seq聯(lián)合揭示了METTL3調控Hspa1a轉錄本的穩(wěn)定性。在METTL3抑制成骨細胞衰老過程中，YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白2（YTHDF2）延緩了Hspa1a mRNA的衰減。METTL3在小鼠成骨細胞中特異性過表達，進一步證實METTL3可以抑制老年骨質疏松癥的進展。相關研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”為題發(fā)表在《cell death discovery》期刊上。
標題：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介導的m6A修飾可增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制成骨細胞衰老）
時間：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實驗方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫熒光和組織學染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨質疏松癥的進展與m6A修飾和METTL3下調密切相關。METTL3過表達可以抑制成骨細胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通過上調Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來抑制成骨細胞衰老。此外，結果表明METTL3通過m6A修飾增強Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來調控成骨細胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白2（YTHDF2）參與METTL3介導的m6A修飾過程中Hspa1a mRNA的穩(wěn)定。從機制上講，METTL3以YTHDF2依賴性方式增加Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性，以抑制成骨細胞衰老。本研究結果證實了METTL3在成骨細胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨質疏松癥的潛在治療靶點。
結果圖形：
（1）老年骨質疏松癥中m6A修飾減少
為了研究與年齡相關的骨質流失與 m6A 修飾之間的關系，進行比色法檢測骨組織中的m6A水平。檢測結果在老年骨質疏松癥患者的骨組織中觀察到m6A修飾水平顯著降低（圖1）。由于m6A修飾主要受甲基轉移酶和去甲基化酶調控，因此在骨組織中檢測METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
圖1：老年骨質疏松癥患者樣本中m6A水平變化以及METTL3等基因和蛋白表達情況。
a. 老年骨質疏松癥患者的骨樣本進行了m6A水平的比色評估。（n=10）
b. 老年骨質疏松癥患者樣本進行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表達的qRT-PCR分析。（n=10）
c. 小鼠骨質疏松癥骨組織進行m6A水平的比色評估。（n=6）
d. western blot分析樣本中的METTL3蛋白水平。（n=6）
e. H2O2誘導的MC3T3-E1細胞衰老過程中m6A水平的比色分析（n=3）。
f. 通過β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
g. 透射電子顯微鏡分析線粒體形態(tài)（n=3）。
h. western blot分析樣本中METTL3蛋白水平（n=3）。
（2）METTL3 抑制體外成骨細胞衰老
在衰老過程中，骨微環(huán)境中的各種細胞類型都會經歷衰老，導致骨形成減少和骨的負平衡。為了研究成骨細胞衰老是否歸因于m6A修飾減少和METTL3表達降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并從C57/BL6小鼠的原代成骨細胞中敲低了METTL3。
圖2：成骨細胞衰老與METTL3促進的m6A變化密切相關。
a. 對METTL3基因敲除后的MC3T3-E1細胞和原代成骨細胞進行m6A水平的比色評估（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 使用免疫熒光鑒定METTL3和p21的定位和表達，bar = 20 μm（n = 3）。
d. JC-1染色分析線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
e. Western Blot檢測METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。
（3）成骨細胞功能對體外骨微環(huán)境代謝的影響
圖3：成骨細胞功能影響骨微環(huán)境。
a. 免疫熒光實驗分析METTL3和p21的表達，bar = 20 μm（n = 3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 使用JC-1染色來評估線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
d. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n = 3）。
e. EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）實驗評估細胞增殖，bar =50μm（n = 3）。
（4）MeRIP-seq揭示METTL3調控Hspa1a穩(wěn)定性
為研究METTL3在調控成骨細胞衰老中的潛在分子機制，研究人員在MC3T3-E1細胞中激活METTL3后，進行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）和mRNA-seq（mRNA測序）。實驗結果表明，在MC3T3-E1細胞中鑒定的m6A位點在 “GGAC”序列中富集（圖4a），大部分m6A位點位于編碼序列（CDS）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。Metagene分析顯示m6A位點主要位于終止密碼子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鑒定出13個共有顯著基因。驗證了7個顯著上調的潛在靶標，qRT-PCR結果顯示Nr4a3和Hspa1a上調更為顯著（圖4b）。在Hspa1a終止密碼子附近發(fā)現(xiàn)m6A峰的高豐度和特異性，表明Hspa1a可能是成骨細胞衰老的關鍵調控因子（圖4c）。通過SRAMP數據庫預測揭示Hspa1a mRNA中的多個高度可靠的m6A修飾位點。在METTL3沉默的MC3T3-E1細胞系和原代成骨細胞中，Hspa1a蛋白表達水平顯著下調（圖4d）。免疫熒光結果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表達下調（圖4e）。RIP-qPCR結果證實Hspa1a mRNA能直接與METTL3蛋白結合（圖4f）。MeRIP-qPCR驗證了在METTL3沉默的細胞系中Hspa1a mRNA的m6A修飾水平顯著降低（圖4g）。隨后進行RNA穩(wěn)定性實驗以分析METTL3介導的m6A修飾對Hspa1a表達調控作用機制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰減速度顯著快于對照組（圖4h）。這些結果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性并減少了其衰減。通過以上實驗，研究人員揭示了METTL3通過m6A修飾正向調控Hspa1a mRNA穩(wěn)定性的機制，并揭示METTL3可能通過這一機制抑制成骨細胞衰老。
圖4： MeRIP-seq揭示METTL3調控Hspa1a穩(wěn)定性。
a. MeRIP-Seq分析顯示，成骨細胞“GGAC”motif在m6A位點富集。
b. 對7個顯著上調的潛在靶標進行qRT-PCR分析（n=3）。
c. Hspa1a終止密碼子附近的m6A峰具有高豐度和特異性。
d. Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。
e. 免疫熒光檢測Hspa1a表達，bar=20μm（n=3）。
f. RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。
g. MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修飾（n=3）
h. qRT-PCR檢測放線菌素D誘導后的mRNA水平以分析降解情況（n=3）。
（5）METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰變
圖5：METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰變。
a. JC-1染色檢測線粒體膜電位，bar=10μm（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 免疫熒光檢測Hspa1a和p21表達，bar=20μm（n=3）。
d. Western Blot檢測METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。
e. RIP-qPCR實驗鑒定與Hspa1a mRNA互作的m6A依賴性蛋白（n=3）。
（6）靶向成骨細胞中的METTL3可抑制老年性骨質疏松癥進展
圖6：靶向成骨細胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨質疏松癥。
a. 小鼠分組和干預措施示意圖（n=6）。
b. c. f. 通過組織學實驗（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）來分析小鼠股骨遠端情況（每組n=3）。
d. 對小鼠股骨遠端進行定量micro-CT分析（每組n=3），以評估骨密度和骨微結構的變化。
e. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中骨代謝標志物水平（每組n=3）。
g.利用免疫組化分析骨組織中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每組n=3），以評估在骨質疏松癥發(fā)展中的作用。
h. METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰減，且METTL3通過抑制成骨細胞衰老來調控老年骨質疏松癥進展的示意圖，bar=50 μm。
參考文獻：
Wang Y, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F, Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar 27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4. PubMed PMID: 38538596.
蘭州大學第二醫(yī)院骨科夏亞一教授和耿彬教授合作，在老年骨質疏松癥患者中揭示了m6A修飾和甲基轉移酶樣3（METTL3）表達降低。進一步體外實驗表明，METTL3抑制了成骨細胞衰老，而成骨細胞功能障礙會影響骨代謝平衡。隨后MeRIP-seq和mRNA-seq聯(lián)合揭示了METTL3調控Hspa1a轉錄本的穩(wěn)定性。在METTL3抑制成骨細胞衰老過程中，YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白2（YTHDF2）延緩了Hspa1a mRNA的衰減。METTL3在小鼠成骨細胞中特異性過表達，進一步證實METTL3可以抑制老年骨質疏松癥的進展。相關研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”為題發(fā)表在《cell death discovery》期刊上。
標題：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介導的m6A修飾可增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制成骨細胞衰老）
時間：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實驗方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫熒光和組織學染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨質疏松癥的進展與m6A修飾和METTL3下調密切相關。METTL3過表達可以抑制成骨細胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通過上調Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來抑制成骨細胞衰老。此外，結果表明METTL3通過m6A修飾增強Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來調控成骨細胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白2（YTHDF2）參與METTL3介導的m6A修飾過程中Hspa1a mRNA的穩(wěn)定。從機制上講，METTL3以YTHDF2依賴性方式增加Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性，以抑制成骨細胞衰老。本研究結果證實了METTL3在成骨細胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨質疏松癥的潛在治療靶點。
結果圖形：
（1）老年骨質疏松癥中m6A修飾減少
為了研究與年齡相關的骨質流失與 m6A 修飾之間的關系，進行比色法檢測骨組織中的m6A水平。檢測結果在老年骨質疏松癥患者的骨組織中觀察到m6A修飾水平顯著降低（圖1）。由于m6A修飾主要受甲基轉移酶和去甲基化酶調控，因此在骨組織中檢測METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
圖1：老年骨質疏松癥患者樣本中m6A水平變化以及METTL3等基因和蛋白表達情況。
a. 老年骨質疏松癥患者的骨樣本進行了m6A水平的比色評估。（n=10）
b. 老年骨質疏松癥患者樣本進行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表達的qRT-PCR分析。（n=10）
c. 小鼠骨質疏松癥骨組織進行m6A水平的比色評估。（n=6）
d. western blot分析樣本中的METTL3蛋白水平。（n=6）
e. H2O2誘導的MC3T3-E1細胞衰老過程中m6A水平的比色分析（n=3）。
f. 通過β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
g. 透射電子顯微鏡分析線粒體形態(tài)（n=3）。
h. western blot分析樣本中METTL3蛋白水平（n=3）。
（2）METTL3 抑制體外成骨細胞衰老
在衰老過程中，骨微環(huán)境中的各種細胞類型都會經歷衰老，導致骨形成減少和骨的負平衡。為了研究成骨細胞衰老是否歸因于m6A修飾減少和METTL3表達降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并從C57/BL6小鼠的原代成骨細胞中敲低了METTL3。
圖2：成骨細胞衰老與METTL3促進的m6A變化密切相關。
a. 對METTL3基因敲除后的MC3T3-E1細胞和原代成骨細胞進行m6A水平的比色評估（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 使用免疫熒光鑒定METTL3和p21的定位和表達，bar = 20 μm（n = 3）。
d. JC-1染色分析線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
e. Western Blot檢測METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。
（3）成骨細胞功能對體外骨微環(huán)境代謝的影響
圖3：成骨細胞功能影響骨微環(huán)境。
a. 免疫熒光實驗分析METTL3和p21的表達，bar = 20 μm（n = 3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 使用JC-1染色來評估線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
d. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n = 3）。
e. EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）實驗評估細胞增殖，bar =50μm（n = 3）。
（4）MeRIP-seq揭示METTL3調控Hspa1a穩(wěn)定性
為研究METTL3在調控成骨細胞衰老中的潛在分子機制，研究人員在MC3T3-E1細胞中激活METTL3后，進行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）和mRNA-seq（mRNA測序）。實驗結果表明，在MC3T3-E1細胞中鑒定的m6A位點在 “GGAC”序列中富集（圖4a），大部分m6A位點位于編碼序列（CDS）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。Metagene分析顯示m6A位點主要位于終止密碼子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鑒定出13個共有顯著基因。驗證了7個顯著上調的潛在靶標，qRT-PCR結果顯示Nr4a3和Hspa1a上調更為顯著（圖4b）。在Hspa1a終止密碼子附近發(fā)現(xiàn)m6A峰的高豐度和特異性，表明Hspa1a可能是成骨細胞衰老的關鍵調控因子（圖4c）。通過SRAMP數據庫預測揭示Hspa1a mRNA中的多個高度可靠的m6A修飾位點。在METTL3沉默的MC3T3-E1細胞系和原代成骨細胞中，Hspa1a蛋白表達水平顯著下調（圖4d）。免疫熒光結果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表達下調（圖4e）。RIP-qPCR結果證實Hspa1a mRNA能直接與METTL3蛋白結合（圖4f）。MeRIP-qPCR驗證了在METTL3沉默的細胞系中Hspa1a mRNA的m6A修飾水平顯著降低（圖4g）。隨后進行RNA穩(wěn)定性實驗以分析METTL3介導的m6A修飾對Hspa1a表達調控作用機制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰減速度顯著快于對照組（圖4h）。這些結果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性并減少了其衰減。通過以上實驗，研究人員揭示了METTL3通過m6A修飾正向調控Hspa1a mRNA穩(wěn)定性的機制，并揭示METTL3可能通過這一機制抑制成骨細胞衰老。
圖4： MeRIP-seq揭示METTL3調控Hspa1a穩(wěn)定性。
a. MeRIP-Seq分析顯示，成骨細胞“GGAC”motif在m6A位點富集。
b. 對7個顯著上調的潛在靶標進行qRT-PCR分析（n=3）。
c. Hspa1a終止密碼子附近的m6A峰具有高豐度和特異性。
d. Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。
e. 免疫熒光檢測Hspa1a表達，bar=20μm（n=3）。
f. RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。
g. MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修飾（n=3）
h. qRT-PCR檢測放線菌素D誘導后的mRNA水平以分析降解情況（n=3）。
（5）METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰變
圖5：METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰變。
a. JC-1染色檢測線粒體膜電位，bar=10μm（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細胞（n=3）。
c. 免疫熒光檢測Hspa1a和p21表達，bar=20μm（n=3）。
d. Western Blot檢測METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。
e. RIP-qPCR實驗鑒定與Hspa1a mRNA互作的m6A依賴性蛋白（n=3）。
（6）靶向成骨細胞中的METTL3可抑制老年性骨質疏松癥進展
圖6：靶向成骨細胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨質疏松癥。
a. 小鼠分組和干預措施示意圖（n=6）。
b. c. f. 通過組織學實驗（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）來分析小鼠股骨遠端情況（每組n=3）。
d. 對小鼠股骨遠端進行定量micro-CT分析（每組n=3），以評估骨密度和骨微結構的變化。
e. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中骨代謝標志物水平（每組n=3）。
g.利用免疫組化分析骨組織中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每組n=3），以評估在骨質疏松癥發(fā)展中的作用。
h. METTL3介導的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調控Hspa1a mRNA衰減，且METTL3通過抑制成骨細胞衰老來調控老年骨質疏松癥進展的示意圖，bar=50 μm。
參考文獻：
Wang Y, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F, Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar 27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4. PubMed PMID: 38538596.
標簽：
DNA甲基化
