病毒準(zhǔn)種（Viral quasispecies）是指遺傳物質(zhì)高度相似但不完全相同的異質(zhì)性病毒群體。早期，病毒準(zhǔn)種研究由單個(gè)病毒模板的Sanger測序完成，但通量低（僅限于幾十種病毒）、成本高，不適合大量病毒的同時(shí)測序。進(jìn)入二代測序，該研究依然面臨讀長短（150-600bp），無法對病毒準(zhǔn)種的跨基因連鎖進(jìn)行有效分析。而PacBio和納米孔測序因?yàn)楣逃械腻e(cuò)誤和PCR過程中引入的錯(cuò)誤，尤其是PCR過程的重組嵌合體多被誤認(rèn)是體內(nèi)病毒重組產(chǎn)生，大大降低了病毒準(zhǔn)種的評估準(zhǔn)確性。

為了解決這類問題，研究人員在第一輪cDNA PCR擴(kuò)增的引物加入6-12nt的唯一分子標(biāo)識符（unique molecular identifiers ，UMIs），標(biāo)記不同來源的病毒，用以消除后續(xù)分析PCR和測序產(chǎn)生的錯(cuò)誤。然而單個(gè)UMI（sUMI）不能保證在PCR過程中始終識別模板轉(zhuǎn)換（如重組）產(chǎn)物。因此在cDNA另一條鏈上加入第二個(gè)UMI，比較不同UMI組合的頻率及家族之間的UMI序列（dUMI），可識別出代表PCR期間“重組”分子的Reads。但是dUMI也存在一些問題，如去除文庫中多余引物的純化步驟造成樣本損失，導(dǎo)致dUMI的準(zhǔn)確度可能和sUMI并無太大差別。因此，迫切需要找到一種有效的測序方法，提高病毒準(zhǔn)種識別和鑒定的準(zhǔn)確性。

華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院微生物學(xué)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)于2023年在《 Virus Evolution 》發(fā)表一篇“Optimized SMRT-UMI protocol produces highly accurate sequence datasets from diverse populations – application to HIV-1 quasispecies”文章聚焦于解決上述問題。在該項(xiàng)研究中，基于PacBio滾環(huán)測序方法，通過比較sUMI和dUMI方法、全自動(dòng)DNA片段回收和磁珠回收，以及不同PCR循環(huán)數(shù)等因素對于文庫制備的影響，開發(fā)了一種適合病毒準(zhǔn)種測序分析的建庫方法。

實(shí)驗(yàn)方法：

構(gòu)建含有UMI-1的引物（圖1A），用該引物反轉(zhuǎn)錄樣本中的RNA生成cDNA（圖1B,1 ）。

對于sUMI樣本，用上一步cDNA直接第一輪PCR擴(kuò)增；對于dUMI樣本，先用一輪PCR引入另一條UMI-2序列，磁珠純化后完成第一輪PCR擴(kuò)增（圖1B,2-5）。

利用美國Sage Science公司的Blue Pippin全自動(dòng)DNA片段回收儀和磁珠法分別回收PCR特定片段長度的產(chǎn)物（圖1B,6 ）。

將回收后的PCR產(chǎn)物再次擴(kuò)增延伸后，磁珠純化去除多余引物（圖1B,7-8 ）。

將 SMRTbell 條形碼接頭連接到 PCR 產(chǎn)物的末端，以形成環(huán)狀分子以供測序（圖1B,9 ）。

PacBio SMRT測序并完成生信分析（圖1C），識別具有同樣UMI的環(huán)狀共有序列 （CCS），最終得到病毒準(zhǔn)種的結(jié)果（圖1D）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在巢式PCR第一輪擴(kuò)增后，分別比較Sage Science公司Blue Pippin和磁珠法純化擴(kuò)增產(chǎn)物以及未純化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Blue Pippin 純化更有效地去除較小片段的 PCR 雜帶，而且產(chǎn)物得率遠(yuǎn)高于磁珠法。（圖2）

圖2 根據(jù)純化方法和PCR循環(huán)數(shù)對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和分析。Blue Pippin純化的條帶更粗，且沒有雜帶，說明回收得率更高，純化效果更好

不僅如此，在巢式PCR第二輪擴(kuò)增中，比較不同純化方法、PCR循環(huán)次數(shù)對PCR產(chǎn)生重組DNA比例的影響，發(fā)現(xiàn)Blue Pippin純化的樣本中，重組DNA雜帶的比例明顯少于磁珠法純化樣本以及未純化樣本。說明Blue Pippin純化效果優(yōu)于磁珠法（圖3）。此外，同樣利用Blue Pippin純化樣本，如果PCR循環(huán)數(shù)越少，純化樣本中重組DNA雜帶的比例也越低。因此，同樣樣本體系，通過Blue Pippin可減少PCR循環(huán)數(shù)并提升文庫質(zhì)量。

圖3 每個(gè)sUMI家族的重組讀長比例，按PCR中的平均模板輸入分組，其中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的sUMI家族，按純化方法和總PCR循環(huán)數(shù)著色。
（Blue Pippin純化樣本的測序?qū)嶒?yàn)結(jié)果說明，相對于磁珠和未純化樣本，Blue Pippin純化能夠有效減少PCR中重組雜帶的產(chǎn)生）

 

通過比較sUMI和dUMI測序結(jié)果，作者設(shè)定了一個(gè)sUMI的檢測閾值線——同一個(gè) sUMI 族中，如果任何位置的最小一致性小于70%，則判定該序列存在重組或者其他錯(cuò)誤（稱為 0.7 判定原則）。利用這一判定原則，作者篩選了sUMI測序結(jié)果并與dUMI的測序結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大部分判定為正確序列的dUMI都能通過0.7 sUMI判定原則。說明這一標(biāo)準(zhǔn)不但有足夠的準(zhǔn)確性，而且避免了dUMI中由于需要額外的純化步驟造成的樣本損失等弊端。

原文鏈接：https://doi.org/10.1101/2023.02.23.529831

總結(jié)

使用Blue Pippin純化PCR產(chǎn)物，使用0.7sUMI判定標(biāo)準(zhǔn)，可以有效提高病毒準(zhǔn)種測序結(jié)果準(zhǔn)確性，并避免dUMI帶來的得率減少等其他弊端。是一種可行的檢測方法。

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