桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system，BEVS）是一種利用桿狀病毒作為基因載體的系統(tǒng)，通過替換病毒中的非必需基因來實(shí)現(xiàn)外源基因的擴(kuò)增和蛋白表達(dá)。具有安全性高、重組蛋白表達(dá)水平高、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因以及易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防性及治療性疫苗和基因治療藥物的研發(fā)及生產(chǎn)^{[1] [2]}。

SF9細(xì)胞系源自草地貪夜蛾SF21細(xì)胞系的克隆分離物^[3]，是用于桿狀病毒表達(dá)的常見細(xì)胞系^[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用SF9懸浮細(xì)胞在CloudReady™ 500mL云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)上進(jìn)行了批次（Batch）培養(yǎng)，最終活細(xì)胞密度（Viable cell density，VCD）達(dá)到1.20×10⁷ cells/mL，活率（Viability）維持在95%以上。驗(yàn)證了CloudReady™能夠用于SF9懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，其穩(wěn)定、智能的參數(shù)控制可以滿足SF9懸浮細(xì)胞在各個(gè)工藝上的條件優(yōu)化，詳見下文。
 

圖1 CloudReady™ 500mL云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)

材料和方法

昆蟲細(xì)胞系最重要的挑戰(zhàn)之一是剪切敏感性，因相對(duì)較大且缺乏細(xì)胞壁而非常脆弱^[5]，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇了兩種轉(zhuǎn)速條件培養(yǎng)SF9細(xì)胞（以R1、R2表示），并以1×10⁶cells/mL的細(xì)胞密度接種。因二氧化碳濃度過高（＞37mmHg）會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)^[6]，本次實(shí)驗(yàn)不通入CO_²，并且恒通空氣0.006vvm（1.5mL/min）。然后將氧氣的通氣級(jí)聯(lián)控制DO。其他參數(shù)控制見表1。
 

表1 工藝控制參數(shù)設(shè)定

結(jié)果和分析

利用表1工藝條件控制，在長(zhǎng)達(dá)144h的培養(yǎng)周期（圖2）后，結(jié)果顯示R1和R2最終活細(xì)胞密度（Viable cell density，VCD）均達(dá)到了1.20×10⁷ cells/mL，且活率（Viability）維持在95%以上（圖3）。實(shí)驗(yàn)過程中pH離線檢測(cè)最低值保持在6.20以上，同時(shí)其他參數(shù)都在D²MS Pro（數(shù)據(jù)和設(shè)備管理系統(tǒng)）控制下穩(wěn)定。而且離線檢測(cè)的pCO₂都在37mmHg以內(nèi)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，與文獻(xiàn)中的結(jié)果一致^[6]（圖3、圖4）。

圖2 SF9細(xì)胞在R1（左）和R2（右）條件下培養(yǎng)周期參數(shù)控制趨勢(shì)圖：— “溫度（℃）”；— ”pH”；— “DO”；— “轉(zhuǎn)速（rpm）”；— “空氣流速（mL/min）”；— “氧氣流速（mL/min）”。
 

圖3 SF9細(xì)胞在R1和R2條件下培養(yǎng)過程增殖曲線及活率變化曲線

圖4 SF9細(xì)胞在R1和R2條件下pH、氧分壓（pO₂）和二氧化碳分壓（pCO₂）變化曲線
在生長(zhǎng)初期，谷氨酰胺（Glutamine）隨著細(xì)胞增殖呈指數(shù)性消耗（圖6），待細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期時(shí)停止消耗并有小幅度回升的趨勢(shì)，這表示谷氨酰胺和葡萄糖(Glucose）一樣在SF9細(xì)胞生長(zhǎng)過程中占重要地位。另外，NH₄⁺濃度和乳酸（Lactate）濃度都在細(xì)胞生長(zhǎng)后期都處于較低值（圖5、圖6），減少了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

圖5 SF9細(xì)胞在R1和R2條件下葡萄糖消耗曲線和乳酸代謝曲線。

圖6 SF9細(xì)胞在R1和R2條件下谷氨酰胺消耗曲線和NH₄⁺濃度變化曲線

[1] 吳清勝, 李媛媛, 姚春萍. 信號(hào)肽對(duì)SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚體蛋白在Expisf9昆蟲細(xì)胞中分泌表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2024, 37 (03): 280-286.

[2] 魏佳琪, 孫振, 薛秀, 孟子燕, 于馨, 劉洋, 張建龍, 姜琳琳, 張興曉, 朱洪偉, 于佳玉. 應(yīng)當(dāng)引起關(guān)注的昆蟲細(xì)胞中的彈狀病毒污染[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2024, 40 (02): 432-437.

[3] Parry Rhys, de Malmanche Henry, Asgari Sassan. Persistent Spodoptera frugiperda rhabdovirus infection in Sf9 cells is not restricted by Wolbachia wMelPop-CLA and wAlbB strains and is targeted by the RNAi machinery[J]. Virology, 2021, 563: 82-87.

[4] Hailun Ma, Andrea Kennard, Nicholas Mattson, Arifa S Khan. Characterization of Sf9 cell clones with differential susceptibilities to Sf-rhabdovirus X+3.7 and Sf-rhabdovirus X- replication[J]. Virology, 2024, 594: 110038-110038.

[5] ÖZLEM AYTEKİN, SAİME İSMET GÜRHAN, KAYOKO OHURA, TERUKO IMAI, GAYE ÖNGEN. Production of recombinant human dipeptidyl peptidase IV from Sf9cells in microbial fermenters[J]. TURKISH JOURNAL OF BIOLOGY, 2016, 40 (1): 217-228.

[6] Vajrala, Sucheta Gowthami. Mechanism of CO2 inhibition in insect cell culture[D]. University of Iowa, 2010.

應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE） 汪興 供稿